鄒寧　蔡雯雯　孫東紅等

摘要 研究了0.15、0.30、0.75、1.50 g/L 4種不同硝酸鈉營養(yǎng)濃度條件對雨生紅球藻生長狀況的影響，同時探究了該試驗條件對雨生紅球藻中蝦青素起始積累期和后期積累量的影響，以尋找既能使雨生紅球藻在氮源用盡后細胞密度達到或接近最大，同時又能最快直接進入蝦青素積累階段的硝酸鈉營養(yǎng)添加濃度。試驗結果表明，硝酸鈉濃度為0.15 g/L時雨生紅球藻細胞生長狀況最好，細胞濃度最高可以達到5.19×105個/ml。此條件下細胞尚未停止生長即已有細胞開始積累蝦青素，變紅（培養(yǎng)的第23天）。使用有機溶劑萃取法以丙酮提取蝦青素，硝酸鈉濃度為0.15 g/L時，最終蝦青素濃度達到19.136 mg/L，是其他硝酸鈉濃度下的蝦青素含量最大值。

關鍵詞 雨生紅球藻；硝酸鈉濃度；蝦青素；丙酮

中圖分類號 S968.41+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-232-03

Effect of NaNO3 Concentrations on Growth of Haematococcus pluvialis and Astaxanthin Accumulation

ZOU Ning， CAI Wenwen， SUN Donghong et al

（College of Life Science， Ludong University， Yantai， Shandong 264025）

Abstract Effects of four different NaNO3 concentrations， 0.15， 0.30， 0.75， and 1.50 g/L， on growth of Haematococcus pluvialis and accumulation of astaxanthin were studied. The optimal NaNO3 concentration for growth of H. pluvialis and accumulation of astaxanthin， early as well as high content was determined when nitrogen is depleted. The extracting agent of astaxanthin is acetone in the process. The results showed that the optimal NaNO3 concentration was 0.15 g/L with 5.19×105 cells/ml the maximal cell density and 19.136 mg/L the maximal astaxanthin content， while the astaxanthin accumulation started at 23th day from the culture.

Key words Haematococcus pluvialis； Sodium nitrate content； Astaxanthin； Acetone

近年來，國內外對抗氧化產品的需求量在不斷增加，天然蝦青素作為目前已知的最強的抗氧化劑在抗癌、增強免疫力[1-3]等醫(yī)藥保健和綠色食品添加劑、化妝美容等相關行業(yè)的需求量不斷攀升，國內外研究人員致力于天然蝦青素產品研制，但蝦青素的純度和產量遠不能滿足市場需求。探究天然蝦青素的高效生產、提取純化工藝是亟待解決的問題。

天然蝦青素的來源主要是細菌、原生動物、真菌、微藻和甲殼類動物，其中以利用真菌和藻類及甲殼類動物提取天然蝦青素為主。目前，天然蝦青素的主要分離純化方法有：酶解法[4]、有機溶劑萃取法、層析法、高效液相色譜法等[5-7]，其中以有機溶劑萃取法的工業(yè)化應用最為廣泛，后兩者由于成本較高等諸多原因多應用于產品研發(fā)階段。

雨生紅球藻[8-9]（Haematococcus pluvialis Flotow）被譽為天然蝦青素的“濃縮品”[10]，因此雨生紅球藻生產天然蝦青素的工藝也成了人們研究的熱點[11]。雖然雨生紅球藻比螺旋藻、小球藻等人類常用保健的微藻具有更強的抗氧化能力，但由于其自身營養(yǎng)階段對光照強度敏感[12]、生長周期長等特點，使得養(yǎng)殖雨生紅球藻的技術要求更高，所以雨生紅球藻的大規(guī)模生產較困難，這就意味著雨生紅球藻的商業(yè)化有著很大的發(fā)展前景。

雨生紅球藻有2種細胞狀態(tài)，即具有鞭毛的運動細胞和無鞭毛的厚壁孢子。它的繁殖方式為無性繁殖[13-16]和有性繁殖[17] 。雨生紅球藻在多種逆境脅迫條件下能夠大量并迅速地積累蝦青素[18]，這是雨生紅球藻的自我保護方式[19]。研究表明，雨生紅球藻只在紅色厚壁孢子階段積累類胡蘿卜素，且其中80%以上為蝦青素[20]。

氮是蛋白質、核酸、磷脂的主要成分，是細胞質、細胞核和酶的組成部分，在植物生命中占有首要地位，被稱為生命元素。在雨生紅球藻生長過程中氮也是不可缺少的元素，一些國內外學者研究了氮對其生長的影響，但結果卻不盡相同。Borowitzka 等認為，硝酸鹽對雨生紅球藻生長的效果好于銨鹽[21]，然而，根據應巧蘭等對797株雨生紅球藻的研究表明，氨氮對雨生紅球藻生長速率的影響是硝酸鹽的1.5倍[22]。有關硝酸鹽濃度的研究中，Borowitzka 等得出對雨生紅球藻生長最有利的硝酸鹽濃度范圍是0.5～1.0 g/L[21]。而吳長斌等的研究結果與Borowitzka 等的研究相差甚遠[22]。由于結果的不一致，近幾年對氮素濃度的研究也是有關雨生紅球藻生長與蝦青素積累研究的熱點問題之一[24-26]。

工業(yè)生產中生產工藝時間的縮短，必然帶來較大的經濟利益。筆者的研究目的便是探究能使雨生紅球藻從生長階段轉入蝦青素積累階段的時間縮短的氮濃度條件。雨生紅球藻的工業(yè)生產過程中氮源常有剩余，且這些未耗盡的氮源無法回收利用，或回收成本過高，因而造成資源和成本的浪費，故而該研究對于雨生紅球藻生產蝦青素的工藝時間的縮短以及成本投入的降低和利潤的提高都有較大的指導意義。

筆者研究了4種不同的硝酸鈉濃度（0.15、0.30、0.75、150 g/L）對雨生紅球藻的生長及蝦青素積累的影響，探究此4種試驗條件中何種氮濃度條件下雨生紅球藻在氮源耗盡后可立即進入蝦青素積累階段并最終獲得較高細胞密度和蝦青素積累量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis Flotow），藻種由魯東大學藻類研究所提供。

1.1.2 主要試劑。

次氯酸鈉，硫代硫酸鈉，檸檬酸鐵，磷酸二氫鉀，檸檬酸，EDTANa2 ，CaCl2， H3BO3，Na2MnO4·2H2O，ZnSO4，MnCl2·4H2O，CuSO4·5H2O。

1.1.3 主要儀器與設備。

UV4802H型分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

PHS3C型酸度計，上海雷磁儀器廠；

FY1HN型真空泵，浙江飛越機電有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雨生紅球藻培養(yǎng)基的配制。

使用BG11培養(yǎng)基，配制4個5 000 ml體系的培養(yǎng)基，并對4個體系作不同的處理，使其硝酸鈉濃度分別為 0.15、0.30、0.75、1.50 g/L。

1.2.2 雨生紅球藻培養(yǎng)條件的控制。

在室溫條件下，將4組不同硝酸鈉濃度的藻液放到日光下培養(yǎng)，pH范圍7.5～90，剛開始藻種密度低時放在陽光不強的地方，以免光照太強藻種光氧化。用ACO系列電磁式空氣泵通氣，供以無機碳源。根據光合作用的原理每天日升前接通空氣泵電源給藻液通氣，日落后切斷空氣泵的電源，既可保證雨生紅球藻生長過程中光合作用所需無機碳源的供應又可節(jié)約能源，提高了能源的利用率。

1.2.3 雨生紅球藻生長測定。

雨生紅球藻細胞密度測定采用血球計數板顯微細胞計數法[21，23]。 細胞干重的測定采用分光光度法，使用分光光度計在674 nm下測雨生紅球藻藻液的吸光度[27]，確定細胞干重和吸光度之間的關系。OD674 nm值和細胞干重之間的相關性標準曲線如圖1所示。

1.2.4 蝦青素的提取方法。

使用有機溶劑萃取法提取蝦青素。研究表明，以丙酮作為萃取劑來提取蝦青素的效果好于其他有機溶劑[28]，且根據魯東大學生命科學學院實驗室以往經驗，丙酮萃取雨生紅球藻中蝦青素的效果要好于乙醇等其他有機溶劑，故該試驗使用丙酮提取雨生紅球藻中的蝦青素。

取5 ml雨生紅球藻在藻液離心后去除上清液，用丙酮分3次進行提取，之后將3次提取液合并并定容至10 ml，用分光光度計測定其OD473值。

1.2.5 蝦青素的計算方法。蝦青素含量計算公式如下：

蝦青素含量（mg/L）=4×A475×丙酮的體積/樣品體積[29]

據有關資料記載，蝦青素在475 nm處有最高吸收波峰，由于儀器設備存在差異，經測定蝦青素在該試驗所用的分光光度計中最高吸收波峰為473 nm。故該試驗所用公式為：

蝦青素含量（mg/L）=4×OD473×丙酮的體積/樣品體積

2 結果與分析

2.1 硝酸鈉濃度對雨生紅球藻密度的影響 雨生紅球藻在不同硝酸鈉濃度下從培養(yǎng)第0天至第102天內的細胞數目的變化如圖2所示。由圖2可以看出，在4個不同硝酸鈉濃度下，雨生紅球藻細胞的數量隨著時間的推移均逐漸增多。在0～4 d時間內，各硝酸鈉濃度下的細胞數量增長幅度相似，但從第4天之后，細胞數量的增長狀況出現了差別。在7～12 d時，雨生紅球藻生長進入對數期，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的反應器中所測得的細胞數目最多，為2.23×105個/ml；硝酸鈉濃度為0.3和0.75 g/L的反應器中測得的細胞數目相似，為（2.1±0.1）×105個/ml；而硝酸鈉濃度為150 g/L的反應器中測得的細胞數目最少。進入穩(wěn)定期后，硝酸鈉濃度為0.15 g/L條件下生長的雨生紅球藻的細胞數目較平穩(wěn)地高于其他三者，其細胞數目最終達到5.194×105個/ml。 0.75 g/L的硝酸鈉濃度的反應器中雨生紅球藻生長狀況次之，細胞濃度最終為4.961×105個/ml。硝酸鈉濃度為0.30 g/L的反應器中雨生紅球藻的生長狀況最差，細胞濃度為3.726×105個/ml。硝酸鈉濃度為1.50 g/L的反應器中的細胞數目變化趨勢線低于0.75 g/L的條件下的雨生紅球藻細胞數目變化趨勢線，但試驗結束時細胞數達5.511×105個/ml。綜合經濟效益、生產效率等因素，從該試驗的結果可見，推薦選用0.15 g/L硝酸鈉濃度培養(yǎng)雨生紅球藻。

2.2 硝酸鈉濃度對雨生紅球藻細胞干重的影響 由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加雨生紅球藻的細胞干重呈上升趨勢。前期4種硝酸鈉濃度條件下生長的雨生紅球藻都出現了細胞干重的快速增加的情況。培養(yǎng)約7 d后，不同硝酸鈉濃度條件下生長的雨生紅球藻的細胞干重出現了差異。試驗最后，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的條件下生長的雨生紅球藻細胞干重最高，為1.525 3 g/L； 硝酸鈉濃度為0.30 g/L的條件下生長的雨生紅球藻的細胞干重最低，為0.719 2 g/L；硝酸鈉濃度為0.75 g/L條件下的雨生紅球藻的細胞干重為0.757 6 g/L；硝酸鈉濃度為1.50 g/L的條件下生長的雨生紅球藻的細胞干重為0.949 9 g/L。

2.3 硝酸鈉濃度對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響

試驗過程中的鏡檢結果表明，在雨生紅球藻培養(yǎng)的第23天，即雨生紅球藻生長進入穩(wěn)定期后，硝酸鈉濃度條件為0.15 g/L的反應器中的雨生紅球藻即開始積累蝦青素，細胞開始變紅。蝦青素最終含量達19.136 mg/L，占細胞干重的1.26%，高于其他試驗條件下的蝦青素含量（圖4、5）。

圖4所示為4種不同的硝酸鈉濃度條件下的雨生紅球藻最終的蝦青素積累量。圖5所示為4種不同的硝酸鈉濃度條件下的雨生紅球藻培養(yǎng)過程中蝦青素積累的情況。硝酸鈉濃度條件為0.30 g/L的反應器中的雨生紅球藻最終蝦青素含量為12.848 mg/L，占細胞干重的1.787%；硝酸鈉濃度條件為0.75 g/L的反應器中的雨生紅球藻最終蝦青素積累量為15.872 mg/L，占細胞干重的2.09%；硝酸鈉濃度條件為1.50 g/L的反應器中的雨生紅球藻蝦青素最終積累量為10.888 mg/L，占細胞干重的1.146%。

3 結論

在硝酸鈉濃度條件分別為0.15、0.30、0.75、1.50 g/L，而其他培養(yǎng)條件相同的情況下，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的反應器中雨生紅球藻生長狀況最好，且在氮源耗盡后最先開始積累蝦青素并獲得最高的蝦青素積累量，為19.136 mg/L，占細胞干重的1.26%。

目前，在雨生紅球藻生產蝦青素的工業(yè)中常使用的氮濃度條件為1.50 g/L，生產中未利用的氮回收困難，造成成本和資源的浪費。前人研究論文中所得培養(yǎng)雨生紅球藻的最優(yōu)氮濃度為0.75 g/L，該研究所得結論的最優(yōu)硝酸鈉濃度015 g/L，低于前人研究所得最優(yōu)氮濃度，更是工業(yè)用1.50 g/L的氮濃度條件的1/10。

且在培養(yǎng)的第23天，硝酸鈉濃度為0.15 g/L的試驗條件下的雨生紅球藻先于其他3個試驗條件下的雨生紅球藻進入蝦青素積累階段，并最終獲得該試驗條件下最高的蝦青素積累量，19.136 mg/L，是1.50 g/L硝酸鈉濃度條件下蝦青素積累量的1.758倍，是0.75 g/L的硝酸鈉濃度條件下蝦青素積累量的1.206倍。

該試驗得出的雨生紅球藻培養(yǎng)所需硝酸鈉濃度低于工業(yè)用氮濃度和前人研究所得培養(yǎng)雨生紅球藻的最優(yōu)氮濃度條件，對雨生紅球藻生產工藝上時間的縮短和成本投入的降低有一定參考意義。

參考文獻

[1] NAKAYAWA K，KIKO T，MIYAZAWA T，et al.Antioxidant effect of astaxanthin on phospholipid peroxidotion in human erythrocytes[J].British Journal of Nutrition，2011，105（11）：1563-1571.

[2] 肖素榮，李京東.蝦青素的特性及應用前景[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（5）：33-35.

[3] CHEWA B P，MATHISONA B D，HAYEK M G，et al.Dietary astaxanthin enhances immune response in dogs[J].Veterinary Immunology，2011，140（3/4）：199-206.

[4] NAGAO T，FUKAMI T，HORITA Y，et al.Enzymatic enrichment of astaxanthin from Haematococcus pluvialis cell extracts[J].JAOCS，2003，80（10）：975-981.

[5] 董建勇.天然藥物化學[M].杭州：浙江大學出版社，2011：22-30.

[6] 黃萌.南極鱗蝦中蝦青素的提取與純化[D].濟南：山東師范大學，2012.

[7] 牟志春，張明，張藝兵，等.高效液相色譜法快速鑒別人工合成蝦青素養(yǎng)殖的三文魚[J].食品科學，2009，30（22）：318-320.

[8] JOTSHI C K，HSIEH C K.Thermal storage in ammoniumalum/ammoniumnitrate eutectic for solar space heating applications[J].Journal of Solra Energy，1998，120（2）：20-24.

[9] 凌善鋒.雨生紅球藻培養(yǎng)基和誘導條件優(yōu)化[J].江蘇農業(yè)科學，2013，41（11）：266-267.

[10] 謝英彪.歐美流行營養(yǎng)補充劑[M].南京：江蘇科學技術出版社，2012：22-36.

[11] 劉建國，劉偉，COHEN Z，等.雪藻高密度連續(xù)培養(yǎng)中生物量和花生四烯酸的高產率[J].海洋與湖沼，2002，33（5）：499-508.

[12] 韋韜，顧文輝，李建，等.雨生紅球藻的光周期效應[J].植物學報，2013，48（2）：168-173.

[13] 邱保勝，劉其芳.紅球藻研究進展[J].水生生物學報，2000，24（5）：546-554.

[14] 劉建國，殷明焱，張京浦，等.雨生紅球藻細胞周期初探[J].海洋與湖沼，2000，31（2）：145-150.

[15] KOBAYSHI M.Morphological changes in the life cycle of the green alga Haematococcus pluvialis[J].J Fermentation and Bioenginerig，1997，84（1）：94-97.

[16] LEE Y K，DING S Y.Cell cycle and accumulation of astaxanthin in Haematococcus lacustris（Chlorophyta）[J].Journal of Phyeology，1994，30（3）：44-59.

[17] 成永旭.生物餌料培養(yǎng)學[M].2版.北京：中國農業(yè)出版社，2005：47.

[18] 張睿欽.雨生紅球藻細胞轉化及蝦青素的提取[D].青島：中國海洋大學，2012.

[19] TJAHJONO A E，HAYAMA Y，KAKIZONO T，et al.Hyperaccumulation of astaxanthin in a green alga Haematococcus pluvialis at elevated temperatures[J].Biotecnology Letters，1994，12（2）：133-138.

[20] LORENZ R T，CYSEWSKI G R.Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J].Tibtech Appil，2000，18（4）：160-167.

[21] BOROWITZKA M A，HUISMAN J M，OSBORE A.Culture of the astaxanthin producing green alga Haematococcus pluvialis，1.Effects of nutrients on growth and cell type [J].Appl Phycol，1991，3（4）：295-304.

[22] 應巧蘭，葉勇.影響雨生紅球藻797株生長和蝦青素積累的某些因素[J].應用與環(huán)境生物學報，2002，8（1）：56-60.