王曉麗　夏偉　張浩等

摘要

[目的]為了對(duì)光合細(xì)菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)方法。[結(jié)果]在實(shí)驗(yàn)室條件下，光照強(qiáng)度為60 W，接種量為10%，培養(yǎng)基初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度 32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。優(yōu)化后，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到112.7 mg/L，比優(yōu)化前增加提高了63.57%。[結(jié)論] 按照優(yōu)化之后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，輔酶Q10的產(chǎn)量得到大幅提高。

關(guān)鍵詞 輔酶 Q10；光合細(xì)菌；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-001-02

Optimization of Cultivation Condition in Photosynthetic Bacteria that Produced Coenzyme Q10

WANG Xiaoli， XIA Wei， ZHANG Hao et al

（Qingdao Zhongren Animal Pharmaceutical Co.，Ltd.， Qingdao， Shandong 266329）

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the cultivation condition of the photosynthetic bacteria.[Method] The single factor method was adopted.[Result] In lab condition， light intensity was 60 W， inoculation was 10%， initial pH of culture medium was 6.5， temperature was 32 ℃， and incubation time was 72 h.Coenzyme Q10 production reached 112.7 mg/L after optimization，and increased by 63.57% compared with preoptimization.[Conclusion] The yield of coenzyme Q10 increased sharply by fermentation according to the optimized cultivation condition.

Key words Coenzyme Q10；Photosynthetic bacteria；Cultivation condition

輔酶 Q10（CoQ10）又稱泛醌，是一種存在于自然界的脂溶性醌類化合物，在原核細(xì)胞內(nèi)存在于細(xì)胞質(zhì)膜中，在真核細(xì)胞內(nèi)主要存在于線粒體內(nèi)，是呼吸鏈中NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和bc復(fù)合物之間的重要遞氫體[1-2]。輔酶 Q10作為呼吸鏈組分之一，參與細(xì)胞能量物質(zhì)——三磷酸腺苷的合成，能抑制線粒體的氧化，維護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性，提高機(jī)體免疫力，在抗腫瘤、高血壓、心臟病及提高免疫系統(tǒng)等方面有重要功能，是臨床價(jià)值頗高的生化藥物[3-5]。

輔酶 Q10的生產(chǎn)方法有4種，分別是動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法因具有廣泛的來(lái)源、相對(duì)簡(jiǎn)單的提取過(guò)程、良好的產(chǎn)物活性、相對(duì)高的產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)而日益受到社會(huì)的關(guān)注[6]。在眾多微生物中，光合細(xì)菌菌體中CoQ10的含量相對(duì)較高。國(guó)外的微生物發(fā)酵技術(shù)較成熟，通過(guò)培養(yǎng)光合細(xì)菌提取CoQ10已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，而國(guó)內(nèi)的微生物發(fā)酵技術(shù)比較薄弱，生產(chǎn)技術(shù)還不成熟，目前主要從動(dòng)物組織中提取[7]。筆者在培養(yǎng)光照強(qiáng)度、接種量、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間5個(gè)方面對(duì)光合細(xì)菌培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為CoQ10相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 供試光合細(xì)菌菌種由青島中仁動(dòng)物藥品有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 20.5 g/L、蛋白胨 2.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、硫酸銨3.5 g/L、醋酸鈉6.5 g/L、硫酸鎂8.5 g /L、硫代硫酸鈉4.8 g/L、硫酸亞鐵1.5 g/L、磷酸氫二鉀2.8 g/L、磷酸二氫鉀3.5 g/L，pH 7.0，121 ℃ 滅菌 30 min。

1.3 液體培養(yǎng)條件

向250 ml三角瓶中加入100 ml培養(yǎng)基，按2%（V∶V）的初始接種量將種子液接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為 30 ℃，60 W白熾燈充當(dāng)光源，150 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h，輔酶Q10的產(chǎn)量達(dá) 68.9 mg/L。

1.4 輔酶 Q10的提取和測(cè)定

量取5 ml發(fā)酵液，在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min 條件下離心 10 min，棄上清，用蒸餾水洗滌1 次，再于轉(zhuǎn)速為5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，加入0.5 ml濃度30% H2O2和2 ml丙酮，用無(wú)水乙醇定容至 10 ml，35 ℃下超聲 50.0 min，用孔徑為0.22 μm 有機(jī)過(guò)濾器過(guò)濾，即可獲得輔酶 Q10樣品。通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng) 275 nm，BEH C181.7 μm 色譜柱（2.1 mm×50.0 mm） ，流動(dòng)相V（甲醇）∶V（乙醇） 1∶4，柱溫 35℃，流速0.4 ml/min[8-10]。

1.5 輔酶 Q10培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 不同光照強(qiáng)度對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

在光合細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，分別以15、40、60、100和200 W的白熾燈充當(dāng)光源對(duì)其進(jìn)行照射，考察輔酶 Q10產(chǎn)量受光照強(qiáng)度的影響。

1.5.2 不同接種量對(duì)輔酶 Q10合成的影響。在光合細(xì)菌接種時(shí)，其接種量分別為2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%（V∶V），考察輔酶 Q10產(chǎn)量受接種量的影響。

1.5.3 不同初始 pH 對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

在光合細(xì)菌培養(yǎng)基配制后，分別將其初始 pH 調(diào)至 5.5、6.0、6.5、7.0、75，8.0，考察輔酶 Q10產(chǎn)量受初始 pH 的影響。

1.5.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

在光合細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，分別將其置于 26、28、30、32、34、36 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，考察輔酶 Q10產(chǎn)量受培養(yǎng)溫度的影響。

1.5.5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

在光合細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，分別在24、48、72、96、120 h不同的發(fā)酵時(shí)間，取發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，考察輔酶 Q10產(chǎn)量受培養(yǎng)時(shí)間的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 光照強(qiáng)度對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

由圖1可知，當(dāng)以60 W白熾燈充當(dāng)光源時(shí)，輔酶 Q10產(chǎn)量最高，達(dá)到68.9 mg/L。隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，輔酶 Q10產(chǎn)量下降。原因可能是當(dāng)光源為60 W白熾燈時(shí)，此條件下光的波長(zhǎng)易被光合細(xì)菌吸收。所以，選擇60 W白熾燈為培養(yǎng)光源。

2.1.2 接種量對(duì)輔酶 Q10合成的影響。由圖2可知，當(dāng)接種量為10%時(shí)，輔酶 Q10產(chǎn)量最高，達(dá)到 86.3 mg/L。過(guò)低的接種量（如2%）導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，輔酶 Q10合成量偏低；而當(dāng)接種量高于10%時(shí)，光合細(xì)菌雖然繁殖迅速，但有限的營(yíng)養(yǎng)成分抑制菌體生長(zhǎng)，輔酶 Q10的合成也隨之降低。

2.1.3 初始 pH對(duì)輔酶 Q10合成的影響。

由圖3可知，當(dāng) pH 值為6.5時(shí)，輔酶 Q10的合成量最高，達(dá)到 108.4 mg/L，偏低或偏高的pH均會(huì)影響輔酶 Q10的合成。這可能是由于培養(yǎng)基初始 pH會(huì)影響光合細(xì)菌的細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而影響菌體對(duì)培養(yǎng)基的利用率，影響輔酶 Q10的合成。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)量的影響。

由圖4可知，在 32 ℃，輔酶Q10的產(chǎn)量達(dá)到最大值（109.0 mg/L），因此發(fā)酵生產(chǎn)的最適溫度為32 ℃。過(guò)低或過(guò)高的培養(yǎng)溫度都不利于輔酶 Q10的合成。

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)量的影響。由圖5可知，在24～72 h，輔酶 Q10累積量迅速升高，達(dá)到112.7 mg/L；在72～120 h，輔酶 Q10的累積量仍然不斷升高，但速度非常緩慢。所以，光合細(xì)菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.2 中試發(fā)酵罐試驗(yàn)對(duì)比

向5 L中試發(fā)酵罐中加入3.5 L培養(yǎng)基，按優(yōu)化之前的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，輔酶Q10產(chǎn)量為66.4 mg/L；按優(yōu)化之后的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，即初始培養(yǎng)基pH調(diào)為6.5，60 W白熾燈充當(dāng)光源，10%（V∶V）的初始接種量，培養(yǎng)溫度為 32 ℃，培養(yǎng) 72 h，提取輔酶Q10，并進(jìn)行檢測(cè)，其產(chǎn)量為100.9 mg/L，比優(yōu)化之前提高52.0%。由5 L中試發(fā)酵罐擴(kuò)大到生產(chǎn)大罐進(jìn)行發(fā)酵，還需要根據(jù)具體的生產(chǎn)情況對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行調(diào)整。

3 結(jié)論

光合細(xì)菌在自然界中普遍存在，是地球上出現(xiàn)最早且具有原始光能合成體系的原核生物。光合細(xì)菌富含輔酶Q10。輔酶Q10是人類生命不可缺少的重要元素之一，具有增強(qiáng)抗氧化、延緩衰老、增強(qiáng)心肌功能、改善細(xì)胞內(nèi)呼吸等多種生理功能，能夠促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高免疫力[11]。光合細(xì)菌的培養(yǎng)條件是影響輔酶 Q10生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[12]。研究表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，當(dāng)光照強(qiáng)度為60 W，接種量為10%，培養(yǎng)基初始pH為6.5，培養(yǎng)溫度為32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量由優(yōu)化前的68.9 mg/L達(dá)到112.7 mg/L，增長(zhǎng)了6357%。5 L中試發(fā)酵罐的試驗(yàn)結(jié)果顯示，按照優(yōu)化之后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，輔酶Q10產(chǎn)量比優(yōu)化之前提高了52.0%。

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