梁春輝，張寒，李雪寧

(1.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003;2.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021;3.興平408 醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 713100)

青莢葉［Helwingia japonica(Thunb)］為山茱萸科(Cornaceae)青莢葉屬(Helwingia Willd)植物，又名葉上花、葉上果，全株入藥。其根味辛，微甘，性平，能驅(qū)風(fēng)除濕，祛瘀活血?？芍挝竿?、痢疾、便血、子宮脫出等病癥。其葉入藥，可治小兒高燒，外用治燒燙傷、毒咬傷，也有清熱解毒、消腫止痛的功效。其干燥莖髓入藥，藥名小通草，具有清熱利尿、下乳等作用［1］。

青莢葉的化學(xué)成分有β-谷甾醇、棕櫚酸甘油酯、桂 皮 酸、6α-H-4-烯-3-酮-豆 甾 醇、6α-H-4-烯-3-酮-豆甾醇［2］等。藥理實(shí)驗(yàn)表明，β-谷甾醇、豆甾醇具有明顯的降膽固醇、止咳、抗癌、抗炎等藥理作用［3］。分析方法有薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法、高效液相色譜-ELSD 法等［4-5］。

本文采用RP-HPLC 測(cè)定青莢葉中豆甾醇含量，豆甾醇與相鄰組分分離度良好，方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率均符合有關(guān)規(guī)定，可用于該藥材的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

豆甾醇對(duì)照品(上海金穗生物科技有限公司，批號(hào):JS90510);甲醇，色譜純;水為娃哈哈純凈水;氯仿等均為分析純;青莢葉，兩批采自秦嶺太白山，兩批購(gòu)自西安萬(wàn)壽路藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室張寒老師鑒定為山茱萸科青莢葉。

Agilent1260 高效液相色譜儀，Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)器;KQ-300B超聲波清洗器;GR-202 分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 豆甾醇對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)定豆甾醇對(duì)照品13.5 mg，置25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)溶解并定容，制成0.54 mg/mL 的豆甾醇對(duì)照品溶液。

1.2.2 豆甾醇供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取青莢葉藥材3 份，置500 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，浸泡1 h，65 ℃水浴回流提取1 h，倒出提取液，再加100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，65 ℃水浴回流提取1 h。倒出提取液，合并兩次提取液，放冷，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。加甲醇∶氯仿(1 ∶1)溶解，移至25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1 ∶1)定容，得供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo C18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流 動(dòng) 相 為 甲 醇∶ 水(97 ∶ 3)，流 速1.0 mL /min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm［6］，理論塔板數(shù)為2 000 以上，豆甾醇峰的分離度符合要求。

2 結(jié)果與討論

2.1 青莢葉中豆甾醇含量測(cè)定

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液5 mL，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾至微量離心管中，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖1、圖2 可知，供試品中豆甾醇與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，達(dá)到基線分離。

圖1 豆甾醇對(duì)照品液相色譜圖Fig.1 Stigmasterol control liquid chromatogram

圖2 青莢葉供試品液相色譜圖Fig.2 Helwingia sample liquid chromatogram

2.2 線性關(guān)系考察

精 密 量 取 對(duì) 照 品 溶 液0. 1，0. 2，0. 4，0. 8，1.0 mL至5 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)定容，搖勻。分別進(jìn)樣20 μL 測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得豆甾醇回歸方程y =6 252.2x－1.176 7，R2=0.999 5(n =5)。結(jié)果表明，豆甾醇進(jìn)樣量在0.216 ～2.16 μg 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 重復(fù)性

精密量取豆甾醇對(duì)照品溶液6 份，各20 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，每份樣品重復(fù)3 次，結(jié)果豆甾醇含量平均峰面積為3 321.37，RSD=1.43%。

2.4 加樣回收率

精密稱(chēng)取青莢葉樣品3 份，精密量取1 mL 對(duì)照品溶液，分別加入到3 份樣品中，進(jìn)行提取制樣，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為97.79%，RSD 為3.107%。

2.5 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液，用0.45 μL 微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果Table 1 Samples for the determination of results

2.6 穩(wěn)定性

精密量取豆甾醇對(duì)照品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 各進(jìn)樣20 μL，分別測(cè)定它們的峰面積，測(cè)得豆甾醇含量的RSD =0.97%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 流動(dòng)相選擇

本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇-水比例90 ∶10，96 ∶4，97 ∶3為流動(dòng)相，流速1. 0 mL/min，結(jié)果表明以甲醇-水(97 ∶3)為流動(dòng)相時(shí)豆甾醇的峰形及出峰時(shí)間(24 min)最佳。此條件下，方法的可靠性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，適用于青莢葉藥材中豆甾醇的含量測(cè)定。

3 結(jié)論

采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定青莢葉中豆甾醇的含量，色譜柱為T(mén)hermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(97∶3)，流速1.0 mL /min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果表明，豆甾醇進(jìn)樣量在0. 216 ～2.16 μg 范圍內(nèi)，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 5)，回收率為97.79%。該法靈敏、簡(jiǎn)單易行，專(zhuān)屬性、重復(fù)性、回收率均符合要求?？勺鳛榍嗲v葉中豆甾醇的含量測(cè)定方法。

［1］ 李雙妹.青莢葉多糖的提取及含量測(cè)定［J］.溫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，10(2):49-52.

［2］ Xia Lizi，Zhou Min，Xiao Yanhua，et al.Chemical constituents from Helwingiajaponica［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8(1):16-20.

［3］ 李英霞，谷顏杰，馬承嚴(yán). HPLC 同時(shí)測(cè)定大豆甾醇提取物中β-谷甾醇和豆甾醇的含量［J］.中成藥，2008，30(5):751-752.

［4］ 王淑美，吳明俠，許閩，等.地黃中β-谷甾醇的含量測(cè)定［J］.黑龍江醫(yī)藥，2001，14(4):255-256.

［5］ 張海波，李欽. HPLC-ELSD 法測(cè)定不同時(shí)期玉米須中β-谷甾醇的含量［J］. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(4):53-55.

［6］ 魏志奇，陳幸，李彬，等.高效液相色譜法測(cè)定川木通中豆甾醇的含量［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(3):574-575.