孟 丹,安敏敏,楊立明,2

(1.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 淮安 223300;2.淮陰師范學(xué)院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 淮安 223300)

硫化氫緩解鋁脅迫對水稻幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控

孟 丹1,安敏敏1,楊立明1,2

(1.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 淮安 223300;2.淮陰師范學(xué)院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 淮安 223300)

硫化氫(H2S)是植物體內(nèi)重要的信號分子,可顯著緩解重金屬對水稻的毒害.以硫氫化鈉(NaHS)作為硫化氫的供體,分別采用0.4 mmol/L NaHS,75 μmol/L AlCl3,75 μmol/L AlCl3+0.4 mmol/L NaHS處理水稻幼苗,測定H2S對水稻幼苗內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的影響.結(jié)果表明,鋁脅迫顯著增加了水稻幼苗體內(nèi)過氧化氫和超氧陰離子的含量,以及超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT)等活性氧清除酶系的活性,而施加H2S供體NaHS顯著降低了過氧化氫和超氧陰離子的含量,以及SOD和CAT的活性.

硫化氫; 水稻; 鋁脅迫; 抗氧化系統(tǒng)

0 引言

鋁對作物的危害主要是由于土壤中可溶性鋁離子含量過多而引起的對作物生長的抑制.在酸性土壤中pH低,可溶性鋁含量高,形成了對作物的毒害.在酸性土壤中作物根系的生長受到抑制,致使地上部和地下部的生長比例失調(diào),并減少對土壤養(yǎng)分的吸收和利用.

研究發(fā)現(xiàn),鋁毒害的主要原因之一是植株體內(nèi)活性氧物質(zhì),如超氧陰離子和過氧化氫的積累引起的氧化脅迫,這些活性氧類的物質(zhì)導(dǎo)致了膜脂的過氧化[1-3].但植株體內(nèi)的活性氧代謝的平衡被打破,活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生和清除主要依賴于酶促和非酶促的抗氧化系統(tǒng)來完成[4].

目前,植物對鋁毒害的抗性涉及到多個信號分子和信號途徑,包括Ca離子、一氧化氮和水楊酸等[5-6].而硫化氫(H2S)作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的氣體信號分子[7],在作物的生長發(fā)育、應(yīng)對環(huán)境脅迫等過程中發(fā)揮重要的作用[8-11].前期我們用硫化氫的供體硫氫化鈉(NaHS)處理鋁脅迫下的水稻幼苗,發(fā)現(xiàn)低濃度的硫氫化鈉可緩解鋁脅迫對水稻幼苗生長發(fā)育的抑制[12].

本文擬采用硫化氫的供體硫氫化鈉處理鋁脅迫下的水稻幼苗,測定硫化氫緩解鋁脅迫下水稻幼苗內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的變化.

1 材料與方法

1.1 實驗材料及其培養(yǎng)

實驗選用水稻品種為kasalath.水稻種子的萌發(fā)與培養(yǎng)參照孟丹等人[12]的方法,并稍作修改.水稻種子在HP1000GS型智能人工氣候箱中發(fā)芽、培養(yǎng).當(dāng)生長至三葉期時進(jìn)行處理,即CK(對照)、0.4 mmol/L NaHS、75 μmol/L AlCl3、75 μmol/L AlCl3和0.4 mmol/L NaHS,每個處理60株苗,每個處理3個重復(fù),每2天更換一次培養(yǎng)液,共處理3次.

1.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

稱取0.5 g的葉片,在液氮中充分研磨,加入預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)室溫下渦旋20 min,10 000 rpm離心20 min,取上清液,采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測定SOD活性[13].

1.3 過氧化氫酶(CAT)活性測定

稱取0.5 g的葉片,在液氮中充分研磨,加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)室溫下渦旋20 min,10 000 rpm離心20 min,取上清液,在240 nm處采用紫外分光光度法測定CAT活性[14].

1.4 超氧陰離子含量的測定

稱取材料1 g,加入少量NBT溶液(6 mmol/L)在室溫下放置1 h,然后放入研磨中加少許石英砂和磷酸緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.5),充分研磨,轉(zhuǎn)入離心管中并于10 000 rpm離心20 min,取上清液并定容至10 mL,分光光度法測定超氧陰離子的含量[15].

1.5 過氧化氫含量的測定

稱取材料0.5 g,加入少量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液(1 mg/mL)在室溫下放置1 h,然后放入研磨中加少許石英砂和0.2 mol/L高氯酸,充分研磨,轉(zhuǎn)入離心管中并于10 000 rpm離心20 min,取上清液并定容至10 mL,分光光度法測定過氧化氫的含量[16].

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 硫化氫緩解鋁脅迫對水稻幼苗葉片超氧化物歧化酶活性的影響

鋁離子是土壤中嚴(yán)重限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重金屬元素脅迫之一,前期研究發(fā)現(xiàn)75 μmol/L的鋁離子對水稻幼苗造成了嚴(yán)重的生長抑制和損傷[12].酶活性測定發(fā)現(xiàn)鋁脅迫在處理6 h葉片內(nèi)SOD的活性增加了4倍,NaHS對水稻葉片內(nèi)SOD酶活性影響較小,僅增加約1.5倍.而在鋁脅迫的幼苗中添加NaHS可顯著地降低了SOD活性,且在處理的前24 h水稻幼苗葉片內(nèi)的SOD活性維持在相同的表達(dá)水平(圖1).

2.2 硫化氫緩解鋁脅迫對葉片過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶(CAT)作為植物體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的重要成員,降解體內(nèi)積累的過氧化氫.在鋁離子脅迫下,水稻幼苗葉片CAT酶活性顯著增加,與對照植株葉片內(nèi)的CAT活性相比增加了近5倍,NaHS對水稻葉片內(nèi)CAT酶活性沒有產(chǎn)生顯著的影響(圖2).而在鋁脅迫下添加NaHS可降低了CAT酶的活性約1.5倍,且在脅迫處理的6 h、12 h和24 h三個時間點,CAT酶活性相對比較穩(wěn)定(圖2).

圖1 H2S、鋁,及H2S緩解鋁脅迫條件下水稻幼苗SOD活性的變化

圖2 H2S、鋁,及H2S緩解鋁脅迫條件下水稻幼苗CAT活性的變化

2.3 H2S對鋁脅迫下水稻幼苗葉片內(nèi)超氧陰離子含量的影響

在鋁單獨(dú)處理下,水稻幼苗葉片內(nèi)超氧陰離子(O·-2)積累速度較快,從脅迫6 h積累增加了3倍,12 h積累增加了10倍,到脅迫24 h積累增加了約16倍.由此可見鋁脅迫通過影響水稻幼苗葉片內(nèi)的物質(zhì)代謝顯著增加了水稻幼苗葉片O·-2的含量,對幼苗葉片產(chǎn)生了嚴(yán)重傷害(圖3).在單獨(dú)NaHS處理幼苗時,水稻幼苗葉片內(nèi)O·-2的含量沒有明顯變化,當(dāng)0.4 mmol/L NaHS處理鋁脅迫下的水稻幼苗與鋁單獨(dú)處理時相比較,發(fā)現(xiàn)水稻幼苗葉片內(nèi)O·-2的含量在6 h沒有明顯變化,而在12 h和24 h出現(xiàn)顯著降低(圖3),說明0.4 mmol/L NaHS可通過降低水稻幼苗葉片O·-2的含量緩解鋁對幼苗地上部的脅迫.

2.4 H2S對鋁脅迫下水稻幼苗過氧化氫含量的影響

重金屬脅迫對植物的脅迫會影響到植株體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)[3,6].由圖4可知,在鋁單獨(dú)處理下的6 h,水稻幼苗葉片內(nèi)過氧化氫含量快速積累,而在鋁脅迫的12 h和24 h過氧化氫含量的增幅略微降低(圖4).盡管單獨(dú)NaHS處理的6、12和24 h,過氧化氫含量比對照分別增加了2.7、1.9和3.4倍,而當(dāng)用NaHS處理鋁脅迫下的水稻幼苗時,葉片內(nèi)過氧化氫含量有顯著降低(圖4),說明0.4 mmol/L NaHS能夠顯著緩解鋁引起的水稻幼苗葉片內(nèi)過氧化氫的積累,以及過氧化氫對葉片的毒害.

圖3 H2S、鋁,及H2S緩解鋁脅迫對水稻幼苗葉片內(nèi)超氧陰離子含量的影響

圖4 H2S、鋁,及H2S緩解鋁脅迫對水稻幼苗葉片內(nèi)過氧化氫含量的影響

3 結(jié)論

鋁脅迫對水稻幼苗的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的傷害,表現(xiàn)為水稻植株葉片內(nèi)超氧陰離子和過氧化氫等活性氧物質(zhì)的積累,誘導(dǎo)了葉片內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的顯著增加,以降解體內(nèi)積累的過量的超氧陰離子和過氧化氫.但用NaHS處理可顯著降低水稻幼苗葉片內(nèi)超氧陰離子和過氧化氫的積累,同時超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性也有所降低.由此推測NaHS緩解鋁脅迫的毒害可以通過調(diào)控超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性降解植株葉片內(nèi)積累的過量超氧陰離子和過氧化氫,以減輕鋁對植株的傷害.

結(jié)合上述結(jié)果,我們推斷H2S在可能作為一種重要的信號分子可能是參與激活了一條以活性氧物質(zhì)的抗氧化信號途徑,調(diào)控水稻幼苗的抗氧化過程,其緩解鋁脅迫以提高植株對逆境的損傷.

[1]Horst W J,Asher C J,Cakmak I,et al.Short-term responses of soybean roots to aluminium[J].J Plant Physiol,1992,140:174-178.

[2]Kuo M C,Kao C H.Aluminum effects on lipid peroxidation and antioxidative enzyme activities in rice leaves[J].Biol Plant,2003,46:149-152.

[3]Tahara K,Yamanoshita T,Norisada M,et al.Aluminum distribution and reactive oxygen species accumulation in root tips of two Melaleuca trees differing in aluminum resistance[J].Plant Soil,2008,307:167-178.

[4]Apel K,Hirt H.Reactive oxygen species:metabolism,oxidative stress,and signal transduction[J].Annu Rev Plant Boil,2004,55:373-399.

[5]Wang Y S,Wang J,Yang Z M,et al.Salicylic acid modulates aluminum-induced oxidative stress in roots of Cassia tora[J].Acta Bot Sin,2004,46:819-828.

[6]Zhang H,Li Y H,Hu L Y,et al.Effects of exogenous nitric oxide donor on antioxidant metabolism in wheat leaves under aluminum stress[J].Russ J Plant Physiol,2008,55:469-474.

[7]Delledonne M.NO news is good news for plants[J].Curr Opini Plant Biol,2005,8:390-396.

[8]Riemenschneider A,Nikiforova V,Hoefgen R,et al.Impact of elevated H2S on metabolite levels,activity of enzymes and expression of genes involved in cysteine metabolism[J].Plant Physiol Biochem,2005,43:473-483.

[9]Zhang H,Shen W B,Zhang W,et al.A rapid response of β-amylase to nitric oxide but not gibberellin in wheat seeds during the early stage of germination[J].Planta,2005,220:708-716.

[10]Zhang H,Hu L Y,Hu K D,et al.Hydrogen sulfide promotes wheat seed germination and alleviates the oxidative damage against copper stress[J].J Integr Plant Biol,2008,50:1518-1529.

[11]Zhang H,Tang J,Liu X P,et al..Hydrogen sulfide promotes root organogenesis in Ipomoea batatas,Salix matsudana and Glycine max[J].J Integr Plant Biol,2009,51:1084-1092.

[12]孟丹,劉玲,陳露,等.外源硫化氫對鋁脅迫下水稻幼苗生長及生理生化的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):63-66.

[13]Beauchamp C,Fridovich I.Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Anal Biochem,1971,44(1):276-287.

[14]Aebi H.1984 Catalase in vitro[J].Methods in Enzymology,105:121-126.

[15]Mookerjee A,Basu J M,Majumder S,et al.A novel copper complex induces ROS generation in doxorubicin resistant Ehrlich ascites carcinoma cells and increases activity of antioxidant enzymes in vital organs in vivo[J].BMC Cancer,2006,6:267.

[16]Kotchoni S O,Kuhns C,Ditzer A,et al.Overexpression of different aldehyde dehydrogenase genes in Arabidopsis thaliana confers tolerance to abiotic stress and protects plants against lipid peroxidation and oxidative stress[J].Plant Cell Environ,2006,29(6):1033-1048.

[責(zé)任編輯：蔣海龍]

Alleviation of Exogenous Hydrogen Sulfide on Rice to Aluminum Stress

MENG Dan1,AN Min-min1,YANG Li-ming1,2

(1.School of Life Sciences,Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)
(2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural and Biotechnology Around Hongze Lake, Huaiyin Normal University,Huaian Jiangsu 223300,China)

Hydrogen sulfide (H2S),an important signal molecular in plants,can alleviate the toxicity of metal stress to crops.In this study,the effects of H2S donor NaHS alleviating AlCl3-induced stress were conducted in the leaves of rice seedlings.We examined the metabolic responses of rice seedlings to aluminum stress focusing on reactive oxygen species (ROS) metabolism including superoxide dismutase and catalase activity.The observed enzyme activities were higher in aluminum-stressed seedlings than in control plants,NaHS decreased the activities of superoxide dismutase and catalase,and the contents of superoxide radical and hydrogen peroxide.Taken together these results suggest that H2S could regulate antioxidant system in rice seedlings leading to the alleviation of iluminum stress.

hydrogen sulfide; rice; iluminum stress; antioxidant system

2014-12-22

江蘇省高校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃重點項目(201410323012Z)

楊立明(1974-)，男，安徽碭山人，副教授，博士，研究方向為植物逆境生理生化.E-mail:yanglm@hytc.edu.cn

Q946

:A

:1671-6876(2015)01-0052-04