張 苗，顧 燕

（1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029；2.江蘇睿博醫(yī)藥有限公司，江蘇南京211112）

HPLC 法在測(cè)定番瀉總苷膠囊中番瀉苷A B含量中的應(yīng)用

張 苗1，顧 燕2

（1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029；2.江蘇睿博醫(yī)藥有限公司，江蘇南京211112）

目的 建立番瀉總苷膠囊中番瀉苷A、B含量的測(cè)定方法。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法，以八烷基硅烷鍵合硅膠柱、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)340nm。結(jié)果 番瀉苷A在0.2104～1.0520μg、番瀉苷B在0.225 0～1.125 0 μg呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.51%（RSD=1.30%）和99.07%（RSD=0.69%）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果可靠，可作為番瀉總苷膠囊質(zhì)量控制的方法。

番瀉葉（中藥）； 膠囊； 番瀉甙/分析； 色譜法，高壓液相

番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉或尖葉番瀉的干燥小葉，具有瀉熱行滯、通便、利水之功效。用于熱結(jié)積滯、便秘腹痛、水腫脹滿[1]。番瀉葉的應(yīng)用歷史悠久，現(xiàn)已成為全世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣的導(dǎo)瀉劑；藥理試驗(yàn)表明，番瀉葉導(dǎo)瀉作用的活性成分主要為蒽醌類的番瀉苷，因而控制番瀉苷的含量可以確保制劑的藥效[2-3]。番瀉總苷膠囊為番瀉葉經(jīng)過提取加工而成的富含番瀉苷活性成分的制劑，本文擬通過試驗(yàn)確立番瀉苷A、B含量的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀（HPLC儀），DAD檢測(cè)器，番瀉苷A（含量大于或等于97.0%，SIGMA公司，批號(hào)：112607015204229），番瀉苷B（含量大于或等于96.5%，SIGMA公司，批號(hào)：110156210605370）等。乙腈為色譜純，三氟乙酸為化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈系統(tǒng)按表1梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；流速1 mL/min；柱溫25℃。理論塔板數(shù)按番瀉苷B峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000，番瀉苷A、B及與其他組分的分離度應(yīng)不低于1.5。

1.2.2 對(duì)照品、供試品及陰性溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取番瀉苷A對(duì)照品適量，以30%乙醇制成50 μg/mL的溶液；同法制備番瀉苷B對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為70 μg/mL。

表1 梯度洗脫表

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取膠囊10粒，傾倒出內(nèi)容物，混合均勻，取內(nèi)容物0.02 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入30%乙醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，加30%乙醇至刻度，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

1.2.2.3 陰性對(duì)照液 稱取輔料0.015 g（按處方比例），精密稱定，置25 mL容量瓶中，與供試品溶液同法制取，作為陰性對(duì)照溶液。

1.2.3 測(cè)定法 分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入HPLC儀，測(cè)定，即得。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 專屬性試驗(yàn) 取陰性對(duì)照液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，分別注入HPLC儀，測(cè)定，考察方法的專屬性。

1.3.2 線性關(guān)系考察 （1）精密稱取番瀉苷A對(duì)照品10.52 mg于100 mL容量瓶中，以30%乙醇溶解定容至刻度，作為番瀉苷A儲(chǔ)備溶液；分別精密移取該溶液2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，30%乙醇溶解定容至刻度，搖勻，制成不同質(zhì)量濃度的一系列溶液，各進(jìn)樣10 μL，2針，考察線性關(guān)系。（2）精密稱取番瀉苷B對(duì)照品11.25 mg，同法制得對(duì)照品番瀉苷B儲(chǔ)備溶液。與番瀉苷A儲(chǔ)備液同法稀釋，制成不同質(zhì)量濃度的一系列溶液，各進(jìn)樣10 μL，2針，考察線性關(guān)系。

1.3.3 精密度試驗(yàn) 按照1.2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以番瀉苷A、B峰面積計(jì)算RSD。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，在第0、2、4、6、8、10、12 h各進(jìn)樣10 μL，計(jì)算峰面積的RSD，考察溶液穩(wěn)定性。

1.3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按1.2.2.2項(xiàng)方法測(cè)定，平行測(cè)定6次，考察重現(xiàn)性。

1.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量樣品（番瀉苷A 2.87%，番瀉苷B 10.02%）0.01 g，平行9份，精密稱定，置25 mL容量瓶中，另取質(zhì)量濃度為76.05 μg/mL的番瀉苷A溶液、質(zhì)量濃度為99.85 μg/mL番瀉苷B溶液，分別按樣品含量的80%、100%、120%精密加入番瀉苷A、B對(duì)照品溶液，用30%乙醇溶解并定容至刻度，每個(gè)質(zhì)量濃度等級(jí)3份，按1.2項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算番瀉苷A、B的回收率。

1.3.7 樣品測(cè)定 取3批樣品 （批號(hào)：131201、131202、131203），按含量測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算番瀉苷A、B的含量。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗(yàn) 專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性制劑在番瀉苷A、B的保留時(shí)間處無干擾。見圖1～4。

圖1 番瀉苷A對(duì)照品溶液

圖2 番瀉苷B對(duì)照品溶液

圖3 番瀉總苷膠囊供試品

圖4 番瀉總苷膠囊陰性制劑

2.2 線性關(guān)系考察 線性關(guān)系考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番瀉苷A在0.210 4～1.052 0 μg、番瀉苷B在0.225 0～1.125 0 μg呈良好的線性關(guān)系。見表2、3。

表2 番瀉苷A線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

表3 番瀉苷B線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

2.3 精密度試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果番瀉苷A峰面積的RSD為0.24%，番瀉苷B峰面積的RSD為0.14%，表明本方法精密度良好。見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 12 h內(nèi)番瀉苷A、B的峰面積RSD分別為0.22%、0.16%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 平行測(cè)定6次，結(jié)果番瀉苷A平均含量為2.87%，RSD為1.01%；番瀉苷B平均含量為10.02%，RSD為1.02%，表明該含量測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。見表6。

2.6 加樣回收試驗(yàn) 番瀉苷A回收率為97.9%～101.9%，平均回收率為99.51%，RSD為1.30%；番瀉苷B回收率為98.1%～100.3%，平均回收率為99.07%，RSD為0.69%。表明該含量測(cè)定方法的回收率較好。見表7、8。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表7 番瀉苷A回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 番瀉苷B回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定 3批樣品的番瀉苷A含量均在2.50%以上，番瀉苷B含量在9.50%以上，可作為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考。見表9。

表9 制劑中番瀉苷A、B含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

番瀉葉含蒽醌及其衍生物、多糖及揮發(fā)油等成分，主要藥理作用的活性成分為蒽醌類。番瀉苷A、B、C、D、G（番瀉苷A的手型異構(gòu)體）等蒽醌類成分在體內(nèi)通過不同途徑轉(zhuǎn)變成大黃酸蒽酮而發(fā)揮作用[4]。通過控制番瀉苷A、B的含量可確保番瀉總苷膠囊的臨床作用。

番瀉苷膠囊為番瀉葉提取物加輔料制備而成，番瀉苷提取物中番瀉苷A、B的含量超過50%，也是制劑中的主要成分，因而選擇番瀉苷A、B的總含量作為控制指標(biāo)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，番瀉苷含量測(cè)定可采用比色法[5]、電泳法[6]、紫外分光光度法[7]、HPLC法[8-10]等，其中HPLC法為近年來常用的方法。該法采用乙腈（5 mmol/L）四庚基溴乙胺的醋酸-醋酸鈉緩沖液（35∶65，pH 5.0）混合溶液作為流動(dòng)相，但配置麻煩。何偉等[11]采用乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液梯度的方法測(cè)定了番瀉葉提取物中的番瀉苷A、B含量；鄔秋萍等[12]采用乙腈-1%冰醋酸溶液梯度的方法測(cè)定番瀉葉中5種主要化學(xué)成分的含量。本研究選擇乙腈-0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相，并摸索到樣品的處理方法及梯度程序。

有研究采用30%乙醇溶解番瀉苷B，番瀉苷A及樣品均用40%乙醇作為稀釋液。為方便操作，嘗試采用30%乙醇溶解番瀉苷A及制劑，并與40%的乙醇進(jìn)行比較，未見明顯差異，故稀釋液均采用30%乙醇。

番瀉苷易被光、熱、強(qiáng)酸等破壞，因而在樣品處理過程中對(duì)溫度進(jìn)行了控制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25℃既能使有效成分充分提取，又不會(huì)遭到破壞。本研究采用的方法穩(wěn)定、結(jié)果可靠，可作為制劑質(zhì)量控制的方法。

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Application of HPLC method for determination of sennoside A and B contents in Senna Total Glycosides Capsules

Zhang Miao1，Gu Yan2
（1.Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210029，China；2.Jiansu Ruibo Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing，Jiangsu 211112，China）

Objective To establish a method for the determination of sennoside A and B contents in Senna Total Glycosides Capsule.Methods The high performance liquid chromatography（HPLC）method was adopted，the gradient elution was performed with octadecyl silane bonded silica gel column，the mobile phase of acetonitrile-0.1%trifluoroacetic acid aqueous solution and the detection wavelength of 340 nm.Results Sennoside A in the range of 0.210 4-1.052 0 μg and sennoside B in the range of 0.225 0-1.125 0 μg had good linear relationship.The average recovery rates were 99.51%（RSD=1.30%）for sennoside A and 99.07%（RSD=0.69%）for sennoside B.Conclusion The established method is simple，quick and reliable，which can be used as a quality control method for Senna Total Glycosides Capsules.

Cassiae angustifolia（TCD）； Capsules； Sennoside/analysis； Chromatography，high pressure liquid

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.011

A

1009-5519（2015）21-3235-03

2015-07-15）

張苗（1987-），女，江蘇徐州人，主要從事藥品調(diào)配工作；E-mail：zm.1987.86@163.com。