王喜連，曠 昕，趙 銘，顏 超

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，湖南衡陽421000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽421001；3.孝感市中心醫(yī)院泌尿外科，湖北432100）

臭氧化生理鹽水對慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷大鼠脊髓TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

王喜連1，曠 昕2，趙 銘2，顏 超3

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，湖南衡陽421000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽421001；3.孝感市中心醫(yī)院泌尿外科，湖北432100）

目的 觀察靜脈注射40 μg/mL臭氧化生理鹽水對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的影響。方法 將24只SD大鼠分成假手術(shù)組（Sham組）、慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷（CCI）組（CCI組）和CCI臭氧化生理鹽水干預(yù)組（Ozone組），每組8只。術(shù)前1 d和術(shù)后7 d測定各組動(dòng)物機(jī)械刺激及熱刺激潛伏期。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測術(shù)后第7天脊髓IL-1β、TNF-α水平。結(jié)果 CCI導(dǎo)致大鼠機(jī)械刺激及熱刺激潛伏期下降，術(shù)后7 d CCI組大鼠與Sham組比較，TNF-α、IL-1β[（3.24±0.21）、（13.13±0.72）pg/mg]水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；靜脈注射臭氧化生理鹽水能降低CCI大鼠的機(jī)械性痛閾及熱痛閾值，且使TNF-α、IL-1β[（1.16±0.04）、（7.89±0.27）pg/mg]的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 靜脈注射臭氧化生理鹽水可能通過抑制脊髓TNF-α、IL-1β的表達(dá)而降低CCI大鼠的痛覺反應(yīng)。

臭氧； 氯化鈉； 脊髓； 結(jié)扎術(shù)； 神經(jīng)系統(tǒng)/病理學(xué)； 疼痛； 大鼠，Sprague-Dawley； 腫瘤壞死因子α； 白細(xì)胞介素1β

神經(jīng)病理性疼痛是與多種周圍神經(jīng)障礙相關(guān)聯(lián)的共同癥狀表現(xiàn)，在神經(jīng)損傷正常愈合后仍可持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年，并伴感覺和運(yùn)動(dòng)功能異常，嚴(yán)重影響患者的生活[1]。近年來有研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)的重塑及免疫系統(tǒng)的激活參與了神經(jīng)病理性疼痛形成過程，而細(xì)胞因子作為聯(lián)系神經(jīng)-免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子，在疼痛的激發(fā)和維持中發(fā)揮了重要作用[2]。本研究采用慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷（CCI）模型建立神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察靜脈注射臭氧化生理鹽水對CCI大鼠機(jī)械性痛閾（采用機(jī)械刺激潛伏期表示）、熱痛閾（采用熱刺激潛伏期表示）及脊髓腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）表達(dá)的影響，探討臭氧化生理鹽水對神經(jīng)病理性疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的可能機(jī)制，為醫(yī)用臭氧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將24只健康成年雄性SD大鼠（由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量200～250 g），隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、手術(shù)組（CCI組）及CCI臭氧化生理鹽水干預(yù)組（Ozone組），每組8只。Ozone組于術(shù)后1 d開始每天尾靜脈注射40 μg/mL臭氧化生理鹽水5 mL/kg，CCI組和Sham組尾靜脈注射相同容積的生理鹽水。所有大鼠分別于術(shù)前1 d、術(shù)后7 d進(jìn)行機(jī)械性痛閾和熱痛閾檢測。術(shù)后7 d處死大鼠，取腰段脊髓，置于-70℃深低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及主要儀器 TNF-α、IL-1β試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），醫(yī)用臭氧治療儀（德國赫爾曼公司），Von Frey纖維絲測痛儀（美國Stoelting公司），BME-410C型全自動(dòng)熱痛刺激儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）等。

1.2 方法

1.2.1 CCI的制備 術(shù)前將動(dòng)物置于安靜、自然光的環(huán)境中飼養(yǎng)48 h以上。保持動(dòng)物在室溫、12 h晝夜節(jié)律，自然飲水、進(jìn)食。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）進(jìn)行麻醉后常規(guī)消毒右后肢，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離肌肉，于股骨后找到坐骨神經(jīng)主干，在坐骨神經(jīng)三叉分支的近側(cè)端約5 mm處，用4-0鉻制羊腸線松扎4處，間距為1 mm，結(jié)扎線以不影響神經(jīng)外膜的血運(yùn)為度，近側(cè)端第1、2道結(jié)扎線結(jié)扎時(shí)可見肢體有輕微抖動(dòng)，第3、4道結(jié)扎線以沒有肢體抖動(dòng)為宜。然后逐層縫合。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素25×105U預(yù)防感染。Sham組僅暴露坐骨神經(jīng)而不進(jìn)行結(jié)扎，其余過程同CCI組。

1.2.2 行為學(xué)測試

1.2.2.1 行為學(xué)觀察 手術(shù)前后觀察大鼠后肢著地的協(xié)調(diào)程度、著地/離地時(shí)間、跛行、爪部畸形，以及舔、咬或激烈抖動(dòng)患側(cè)足等自噬現(xiàn)象。

1.2.2.2 機(jī)械刺激潛伏期（PWML） 采用Von Frey纖維絲測定雙后肢機(jī)械痛閾，即將大鼠固定在特制的、大小為220 mm×220 mm×280 mm有機(jī)玻璃罩內(nèi)，放在高為360mm的金屬籠架實(shí)驗(yàn)臺上，用不同壓力的纖維絲（從小到大）刺激其雙側(cè)足底，每次間隔5 s，直至找到出現(xiàn)50%（10次）抬足反應(yīng)的纖維絲，記錄其壓力值，并將其設(shè)定為閾值。所有測定均于9：00～10：00進(jìn)行。

1.2.2.3 熱刺激潛伏期（PWTL） 將大鼠固定在特制的、大小為220 mm×220mm×280 mm有機(jī)玻璃罩內(nèi)，放在高為360 mm的實(shí)驗(yàn)臺上，實(shí)驗(yàn)臺的玻璃板厚約2 mm。調(diào)整光源與后肢足底的距離及光輻射強(qiáng)度，使基礎(chǔ)PWTL在5～10 s。單次光照射時(shí)間不超過20 s，同一部位刺激的間隔時(shí)間為5 min，以開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間表示熱痛閾，連續(xù)測定3次，取平均值。

1.2.3 組織取材 戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射深度麻醉，用剪刀截取腰段椎體，從骶段椎管內(nèi)快速注射冰冷生理鹽水將完整的脊髓沖出，用刀片截取腰膨大部位的脊髓（相當(dāng)于L4～6脊髓），快速放入液氮中凍存，在-70℃深低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 組織勻漿 檢測前將組織取出稱質(zhì)量，然后將脊髓置于預(yù)冷組織勻漿液中[0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7.4，含有1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）]，用玻璃勻漿器在4℃下勻漿，20 000 r/min離心30 min，取上清液，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 脊髓組織勻漿生化指標(biāo)測定 嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟測定TNF-α、IL-1β水平。所有標(biāo)本均為雙管檢測，結(jié)果以“pg/mg”表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用完全隨機(jī)資料方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)測試 三組大鼠術(shù)前1dPWML、PWTL比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后7 d，CCI組PWML、PWTL較術(shù)前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），Shan組、Ozone組大鼠術(shù)后7 d PWML、PWTL與術(shù)前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而CCI組術(shù)后7 d PWML、PWTL較Sham組和Ozone組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1、2。Ozone大鼠右后支跛行、縮足等現(xiàn)象明顯改善。

2.2 三組大鼠術(shù)后7 d脊髓TNF-α和IL-1β檢測結(jié)果比較 術(shù)后7 d CCI組大鼠脊髓TNF-α、IL-1β水平較Sham組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Ozone組大鼠骨髓TNF-α、IL-1β水平較CCI組均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而與Sham組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表1 三組大鼠手術(shù)前后右后肢PWML比較（±s，g）

表1 三組大鼠手術(shù)前后右后肢PWML比較（±s，g）

注：與Sham組、Ozone組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.01；與同組術(shù)前1 d比較，bP＜0.01。

術(shù)前1 d 術(shù)后第 7天組別Sham組CCI組Ozone組n 888 46.48±4.34 47.78±3.37 46.85±3.30 47.71±2.19 16.41±1.67ab45.57±2.45

表2 三組大鼠手術(shù)前后右后肢PWTL比較（±s，s）

表2 三組大鼠手術(shù)前后右后肢PWTL比較（±s，s）

注：與Sham組、Ozone組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.01；與同組術(shù)前1d比較，bP＜0.01。

術(shù)前1 d 術(shù)后第7天組別Sham組CCI組Ozone組n 888 8.13±0.72 7.90±0.62 7.94±0.61 8.12±0.63 5.09±0.35ab8.02±0.65

表3 三組大鼠術(shù)后7d脊髓TNF-α和IL-1β檢測結(jié)果比較（±s，pg/mg）

表3 三組大鼠術(shù)后7d脊髓TNF-α和IL-1β檢測結(jié)果比較（±s，pg/mg）

注：與Sham組、Ozone組比較，aP＜0.01。

組別Sham組CCI組Ozone組n 888 TNF-α IL-1β 1.11±0.11 3.24±0.21a1.16±0.04 5.23±0.14 13.13±0.72a7.89±0.27a

3 討 論

神經(jīng)系統(tǒng)特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重塑與神經(jīng)病理性疼痛的激活密切相關(guān)，在神經(jīng)病理性疼痛的維持和慢性化過程中，脊髓背角突觸的可塑性改變和中樞敏化起重要作用[3-4]。中樞敏化過程主要為膠質(zhì)細(xì)胞的激活及相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞因子包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、IL-1β、IL-6、TNF-α及前列腺素（PGs）等，膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞分子通過作用于突觸前自身受體激發(fā)突觸前囊泡大量釋放致痛物質(zhì)[5]，同時(shí)，作用于突觸后神經(jīng)元上自身受體激發(fā)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致痛覺信號的過度放大，從而引發(fā)中樞敏化和病理性疼痛的瀑布式放大效應(yīng)[6]。另外，免疫系統(tǒng)在神經(jīng)病理性疼痛的形成及維持階段發(fā)揮了重要作用[2]，聯(lián)系神經(jīng)-免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子的細(xì)胞因子可能通過激活炎癥細(xì)胞而加重炎性反應(yīng)，促進(jìn)興奮性氨基酸、NO、氧自由基的釋放，敏化脊髓背角神經(jīng)元而介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛[7]。在神經(jīng)病理性疼痛中可能發(fā)揮重要作用的主要有TNF-α、IL-1、IL-6等。有研究表明，神經(jīng)損傷的早期脊髓組織中TNF-α mRNA及其蛋白的表達(dá)迅速升高，提示TNF-α可能在神經(jīng)病理性疼痛形成的最初階段發(fā)揮重要作用。外周神經(jīng)損傷后脊髓組織中IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)增加，而鞘內(nèi)應(yīng)用IL-1β和TNF-α拮抗劑可出現(xiàn)劑量相關(guān)的抑制神經(jīng)病理性痛覺過敏，由此證實(shí)，IL-1β和TNF-α與神經(jīng)病理性疼痛的激活有關(guān)[8-9]。鑒于細(xì)胞因子在神經(jīng)病理性疼痛中的關(guān)鍵作用，以炎性反應(yīng)或促炎性細(xì)胞因子作為靶點(diǎn)的疼痛治療策略逐漸受到關(guān)注。

醫(yī)用臭氧具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，現(xiàn)已用于促進(jìn)壓瘡愈合、椎間盤突出癥、外周血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及疼痛等治療[10]。坐骨神經(jīng)痛或腰背部疼痛患者通過神經(jīng)根局部注射臭氧能夠有效減輕疼痛程度。局部注射醫(yī)用臭氧可顯著緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型實(shí)驗(yàn)中的痛覺過敏[11]，說明臭氧局部應(yīng)用能有效緩解神經(jīng)病理性疼痛程度。目前認(rèn)為，臭氧局部注射可直接作用于神經(jīng)末梢，刺激中間神經(jīng)元釋放腦啡肽等物質(zhì)，而臭氧代謝后于局部直接改善神經(jīng)末梢組織缺氧狀況，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。單次皮下注射臭氧能降低神經(jīng)痛大鼠的疼痛程度且降低神經(jīng)組織中炎癥因子的表達(dá)，提示臭氧可能通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥因子的表達(dá)而有效降低神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺過敏程度[12]。醫(yī)用臭氧自體血回輸療法是臭氧全身應(yīng)用治療的主要方法，因其受外周血管狀況的影響，臨床應(yīng)用不方便[13]。因此，能否以臭氧化液體靜脈滴注方法替代臭氧自體血回輸療法一直在探索中。Bocci[14]發(fā)現(xiàn)，臭氧化生理鹽水能很好地保存臭氧及其衍生物，但高濃度臭氧化生理鹽水（臭氧質(zhì)量濃度80 μg/mL）靜脈滴注對血管有刺激性，可能引起化學(xué)性靜脈炎。臨床實(shí)踐結(jié)果顯示，低濃度臭氧化生理鹽水靜脈滴注具有臭氧自體血回輸療法相同的療效，且無明顯不良反應(yīng)[15]。

本研究采用傳統(tǒng)CCI技術(shù)建立神經(jīng)病理性疼痛模型，術(shù)后7 d測定PWML及PWTL，與術(shù)前比較，CCI組大鼠PWML、PWTL均下降，而Sham組與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明CCI組成功復(fù)制出神經(jīng)病理性疼痛。術(shù)后每天通過靜脈注射臭氧化生理鹽水，術(shù)后7d大鼠PWML、PWTL較CCI組增高，脊髓TNF-α及IL-1β水平較CCI組降低。由此可推斷，靜脈注射40 μg/mL臭氧化生理鹽水可通過抑制脊髓TNF-α及IL-1β的表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

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Effect of ozonated normal saline on spinal cord IL-1β and TNF-α expression in rat with sciatic nerve chronic constriction injury

Wang Xilian1，Kuang Xin2，Zhao Min2，Yan Chao3
（1.Department of Pain；2.Department of Anesthesiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China；3.Department of Urologic Surgery，Xiaogan Municipal Central Hospital，Xiaogan，Hubei 432100，China）

Objective To investigate the effects of intravenous injection of 40 μg/mL ozonated normalsaline on the expression of spinal cord tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-1β（IL-1β）in rats with chronic neuropathic pain.Methods 24 SD rats were randomized into the sham operation group（sham group），sciatic nerve chronic constriction injury group（CCI group）and the ozonated normal saline group（Ozone group），8 cases in each group.The paw withdrawal thermal latency（PWTL）and paw withdrawal mechanic threshold（PWMT）were measured before operation and on postoperative 7 d.The expression levels of spinal cord TNF-α and IL-1β on postoperative 7 d were detected by the double antibody sandwich ELISA.Results Sciatic nerve chronic constriction injury（CCI）induced the decrease of PWTL and PWMT（P＜0.01）；the expression of spinal cord TNF-α and IL-1β on postoperative 7 d in the CCI group were increased[（3.24±0.21）pg/mg，（13.13±0.72）pg/mg]，there was statistical dif ference compared with the sham operation group（P＜0.01）；intravenous injection of ozonated normal saline could decrease PWTL and PWMT，moreover the TNF-α and IL-1β levels were decreased[（1.16±0.04），（7.89±0.27）pg/mg，P＜0.01].Conclusion Intravenous injection of ozonated normal saline could decrease the pain sensation in CCI rat by inhibiting the expression of TNF-α and IL-1β in spinal cord.

Ozone； Sodium chloride； Spinal cord； Ligation； Nervous system/pathology； Pain； Rats，sprague-dawley； Tumor necrosis factor-alpha； Interleukin-1beta

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.004

A

1009-5519（2015）21-3217-03

2015-08-16）

湖南省衡陽市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013KJ51）。

王喜連（1977-），女，湖南溆浦人，碩士研究生，主要從事急慢性疼痛的診治工作；E-mail：wxl553@163.com。