劉愛紅， 沈楨巍, 雷 撼

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室,上海 200120； 3. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸科， 上海 200120)

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·基礎(chǔ)研究·

三磷酸腺苷對(duì)小鼠內(nèi)源性β防御素2表達(dá)的作用研究

劉愛紅1， 沈楨巍2, 雷 撼3

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室,上海 200120； 3. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸科， 上海 200120)

目的 研究三磷酸腺苷(ATP)對(duì)小鼠內(nèi)源性β防御素2(mice β-defensin-2 mBD-2)表達(dá)的影響，探討提高機(jī)體抗感染防御能力的途徑和方法。方法 取60只小鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組(N，30只)和實(shí)驗(yàn)組(T，30只)，實(shí)驗(yàn)組小鼠每只體內(nèi)注入相同劑量的ATP，對(duì)照組小鼠注射等劑量的生理鹽水，于注射后不同時(shí)間段12h(T1組)、24h(T2組)、36h(T3組)分別(10只/組)提取小鼠肺組織，檢測(cè)內(nèi)源性mBD-2mRNA的表達(dá)，同時(shí)制作肺組織病理標(biāo)本，用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠肺組織中mBD-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，經(jīng)ATP處理后，實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)源性mBD-2 mRNA的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組間比較，T2組mBD-2 mRNA表達(dá)水平較T1組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；T2組mBD-2 mRNA表達(dá)水平較C組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；mBD-2 mRNA表達(dá)水平在T1組和T3組之間無差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。免疫組化結(jié)果提示經(jīng)ATP作用后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中mBD-2蛋白表達(dá)上調(diào)，在24h達(dá)強(qiáng)陽性，與12h和36h相比有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 體內(nèi)注射外源性ATP可以上調(diào)小鼠肺組織mBD-2 mRNA的表達(dá)，且mBD-2 mRNA及mBD-2蛋白的表達(dá)隨ATP作用時(shí)間的不同而不同，其在24h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值。

三磷酸腺苷； β-防御素2； mRNA； 小鼠

防御素(defensin)具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，其獨(dú)特的殺菌機(jī)制不易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株，具有作為新型抗生素的潛在應(yīng)用前景，成為近年來抗感染研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。β防御素2是防御素中重要的一種，具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特性[1]，其主要的可能機(jī)制和途徑是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高導(dǎo)致信號(hào)通路的激活。ATP具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度的作用，本研究旨在探討外源性ATP對(duì)小鼠肺組織mBD-2基因表達(dá)的影響以及兩者之間時(shí)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠60只，清潔級(jí)，4～6周齡，體質(zhì)量20～30g，雌雄不限，購(gòu)自上海同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在普通清潔級(jí)條件下飼養(yǎng)，自由取水、攝食。隨機(jī)分為對(duì)照組(30只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)，再按照注射藥物后作用時(shí)間的不同，分別將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠分為3個(gè)亞組，即對(duì)照組: N1(12h)、N2(24h)、N3(36h)；實(shí)驗(yàn)組: T1組(12h)、T2組(24h)、T3組(36h)，每組10只。

1.2 主要試劑

Trizol試劑、RNA提取試劑盒(上海華舜有限公司)，M-MLV First Stand Kit、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG、trizol、引物(invitrogen公司)，B-防御素2及內(nèi)參B-Actin的合成(上海生工生物工程公司)，DNA Mraker DL2000(TAKARA公司)，三磷酸腺苷(ATP)(上海第一生化藥業(yè)有限公司)。

目標(biāo)基因mBD-2引物序列如下: 上游引物: 5′-GAA CTT GAC CAC TGC CAC ACC-3′，下游引物: 5′-GCT CTA GAT TAT CAT TTC ATG TAC TTG CAC C-3′，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin引物序列為: 上游引物: 5′-AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC-3′，下游引物: 5′-GGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3′(委托上海生工生物技術(shù)公司合成)。

1.3 主要器材

熒光定量PCR儀Bio-rad IQ5System，紫外分光光度計(jì)(Bio-rad, SmartSpec TM 3000，美國(guó))；Biofuge 28RS低溫高速離心機(jī)(Heraeus，德國(guó))；680l酶標(biāo)儀、凝膠圖象分析系統(tǒng)(Bio-RAD，美國(guó))，Labofuge400R高速冷凍離心機(jī)(Heraus德國(guó))。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物處理 將小鼠分別稱重，按照ATP人用劑量80mg/kg折算，小鼠ATP用量為 16mg/kg。固定小鼠，經(jīng)尾靜脈進(jìn)行藥物注射，A組小鼠在12h后處死，B組小鼠在24h后處死，C組小鼠在36h后處死，提取各組小鼠肺組織備檢。

1.4.2 提取小鼠肺組織總RNA 取小鼠肺組織 70～80mg，在液氮中研磨，直至樣品成細(xì)粉狀；加 1ml Trizol到每個(gè)空管中，將研磨好的樣品放入Trizol中，輕混后4℃放置10min，離心半徑10cm 10000g離心 10min，取上清液，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)入新的EP管；每管加入200μl氯仿混勻，室溫靜置 7～8min，離心半徑10cm，12000g離心15min；收集上清液約400～600μl，注意不要吸到中下層；上清液轉(zhuǎn)管加入250μl異丙醇，輕混靜置10min，12000g離心15min，離心半徑10cm。棄上清液；加入無水乙醇1ml洗沉淀，輕混，離心半徑10cm 12000g離心15min，收集沉淀，加入90%無水乙醇(900μl無水乙醇+100μl DEPC水)洗沉淀，輕混，離心半徑10cm，12000g離心 15min；收集沉淀，加入75%乙醇1ml輕混，離心半徑10cm， 12000g離心15min；吸干管中殘留液體，吹干 (2min)，直至管中無酒精氣味；加入適量(最少 20μl)DEPC水溶解沉淀，-80℃保存。

1.4.3 RNA濃度與純度鑒定 (1) 電泳鑒定: 吸取5μl總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓30min，凝膠成像儀照像，檢測(cè)總RNA的完整性與純度，見圖1。(2) RNA濃度測(cè)定: 取2μl經(jīng)過TE緩沖液10倍稀釋的RNA樣品，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度，OD260/OD280的比值和OD260/OD230的比值。

圖1 小鼠肺臟組織總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoregram of total RNA from mouse lung tissue

1.4.4 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟: (1) 將以下組分加入無核酸酶的微量離心管中: Oligo(dT) 1μl；總RNA 2μg；10m mol dNTP 1μl；加入滅菌蒸餾水至 12μl；(2) 混合物在65℃加熱5min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分: 5×第一鏈合成緩沖液 4μl；0.1m DTT 2μl；(3) 在離心管中輕輕將各種成分混合，并在37℃下孵育2min；(4) 在室溫下加入1μl(200U)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕吹打混勻；(5) 在37℃孵育50min；(6) 在70℃加熱15min以終止反應(yīng)。

1.4.5 熒光定量PCR檢測(cè)mBD-2 mRNA的表達(dá) 反應(yīng)體系: ddH2O 5.3μl；酶10μl；上游引物0.35μl；下游引物0.35μl；cDNA模板4μl。目標(biāo)基因β-BD-2反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2min，95℃變性20s，59℃退火30s，72℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因β-actin反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2min，95℃變性 20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算β-BD-2 mRNA的表達(dá)水平。

1.4.6 組織病理學(xué)檢測(cè) 各組小鼠均取左肺上葉，剪取一小塊組織，標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液充分固定，常規(guī)石蠟包埋，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片2張做免疫組織化學(xué)，觀察肺組織中mBD-2蛋白的表達(dá)情況。切片厚度4μm。采用SP法免疫組織化學(xué)染色，一抗: 兔抗鼠mBD-2單克隆抗體按1∶100稀釋。結(jié)果判讀: 每張病理組織切片選5個(gè)視野，拍攝200×的數(shù)碼照片，各組共拍攝150張照片。凡細(xì)胞漿內(nèi)未著色者為0分、淺棕色者為1分、棕色者2分、深棕色者為3分；整塊切片中陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞中的比例<30%為1分、30%～70%為2分、>70%為3分、無細(xì)胞著色為0分。根據(jù)上述兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)分為4級(jí),0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4分為陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性 (+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 小鼠內(nèi)源性mBD-2 mRNA的檢測(cè)

經(jīng)ATP處理后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)源性mBD-2 mRNA的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，差異有顯著意義。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的24h組mBD-2 mRNA表達(dá)水平較12h組(12h)高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；24h組mBD-2 mRNA表達(dá)水平較36h組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；mBD-2 mRNA表達(dá)水平在12h組(12h)和36h組(36h)之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)，見表1。

表1 ATP作用不同時(shí)間小鼠內(nèi)源性β-BD-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量

實(shí)驗(yàn)組內(nèi)B與A組相比，**P<0.01，B組與C組相比，**P<0.01，A組與C組相比，*P>0.01

2.2 免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組小鼠肺組織見各級(jí)支氣管腔黏膜層表達(dá)少量mBD-2(圖1: N1-N3)，在各時(shí)間段均呈弱陽性；實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織見各級(jí)支氣管腔黏膜上皮表達(dá)大量mBD-2，在12h為陽性，在24h達(dá)強(qiáng)陽性，在36h為陽性(圖1: T1-T3)。

圖2 各組小鼠肺組織中mBD-2的表達(dá)×200Fig.2 Expression ofmBD-2 protein in mouse lung tissue at different time points after ATP treatment demonstrated by immunohistochemisry

3 討 論

β防御素2具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，不僅可以直接抵抗病原微生物的感染，而且還可以通過啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)來提高機(jī)體抵抗微生物感染的免疫水平，在皮膚、黏膜，尤其是氣道黏膜的抗感染免疫防御中具有重要作用[2-3]。

β防御素2的殺菌譜很廣，包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和嗜血桿菌等[2]，其抗微生物活性主要是通過破壞細(xì)菌脂質(zhì)膜的完整性，引起細(xì)胞膜滲透性發(fā)生改變而起作用。有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，rBD-2高表達(dá)能顯著提高大鼠對(duì)金色葡萄球菌攻擊的耐受性，抑制大鼠呼吸道rBD-2表達(dá)量，可使呼吸道對(duì)抗細(xì)菌感染的能力大大降低；王玉愛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的唾液支原體中加入不同濃度的β防御素2，唾液支原體的抑制率可達(dá)90%。β防御素2具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特性，可能通過多種信號(hào)途徑被誘導(dǎo)，前期研究發(fā)現(xiàn)NF-κB參與并促進(jìn)了誘導(dǎo)物誘導(dǎo)β防御素2基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高從而激活NF-kB信號(hào)通路是β防御素2誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵因素。

ATP是體內(nèi)的高能化合物，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸及核苷酸等物質(zhì)的代謝，是各種生物體內(nèi)不可或缺的重要能量物質(zhì)。近年，研究發(fā)現(xiàn)ATP還具有抗感染作用，可以通過對(duì)炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的趨化、募集、激活作用，誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放和增加參與機(jī)體宿主抗感染免疫的過程[5-6]。Xiang等發(fā)現(xiàn)，ATP可誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞分泌釋放IL-1和其他趨化因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向腹腔的募集[7]。Lee發(fā)現(xiàn)病毒感染使機(jī)體ATP生成顯著增加，ATP通過與P2Y(2)受體的結(jié)合誘導(dǎo)各種炎癥介質(zhì)的釋放，促進(jìn)抗感染免疫反應(yīng)的進(jìn)行。ATP還具有細(xì)胞間信息傳遞功能，是非特異性鈣調(diào)節(jié)劑，可通過影響細(xì)胞內(nèi)外鈣離子水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，前期在培養(yǎng)的人原代氣道細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，ATP可通過動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放和細(xì)胞外鈣內(nèi)流引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，使NF-κB激活而引起β防御素2表達(dá)升高。另外，ATP是臨床廣泛使用的基礎(chǔ)藥物，安全可靠容易獲得。因此，選擇ATP作為誘導(dǎo)劑來探討ATP對(duì)動(dòng)物的內(nèi)源性β-防御素2的影響。

本研究以小鼠為對(duì)象，靜脈注射相同劑量的ATP，不同時(shí)間點(diǎn)提取小鼠肺組織，對(duì)內(nèi)源性mBD-2 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示在注射ATPY 12、24、36h后，小鼠肺組織中mBD-2 mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)，同時(shí)mBD-2蛋白的表達(dá)也顯著上調(diào)，兩者的表達(dá)水平均在24h達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期細(xì)胞水平的研究相一致，但外源性ATP誘導(dǎo)體內(nèi)β-防御素2的表達(dá)機(jī)制可能是多方面的，除了ATP通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平激活NF-kB信號(hào)通路上調(diào)β-防御素2表達(dá)外，還可能： (1) ATP注射后增加了小鼠體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝，使各項(xiàng)生命活動(dòng)加強(qiáng)，mBD-2合成得以增加；(2) ATP引起細(xì)胞鈣離子水平顯著增加，進(jìn)而激活一系列鈣依賴的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放和增加，間接誘導(dǎo)mBD-2的合成。經(jīng)ATP刺激后，機(jī)體尚處于固有免疫的早期階段，β-防御素2的合成與釋放處于持續(xù)狀態(tài)，并在24h達(dá)到高峰，之后合成與釋放均減少，其表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，本研究證實(shí)外源性ATP對(duì)小鼠肺組織mBD-2及其蛋白的表達(dá)有一定的誘導(dǎo)作用，其機(jī)制可能是通過信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控和機(jī)體功能代謝實(shí)現(xiàn)的，ATP可以通過提高mBD-2參與機(jī)體的抗感染免疫過程。今后需對(duì)其具體的作用機(jī)制開展深入研究和探討，對(duì)ATP誘導(dǎo)β防御素2預(yù)防、治療感染性疾病的效果開展研究，為臨床應(yīng)用提供思路和方法。

[1] Shen Z, Lei H. Expression of hBD-2 induced by 23-valemt pneumococcal polysaccharide vaccine, Haemophilus influenza type b vaccine and split influenza virus vaccine[J]. Molecular Med Reports, 2012(7): 733-738.

[2] 顏露春，黃星，游瓊，等.LPS介導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)HBD-2表達(dá)的影響[J].免疫學(xué)雜志,2011,03(5): 243-245.

[3] 黎觀紅,洪智敏,賈永杰，等.鼠李糖乳酸桿菌LG_A對(duì)雞小腸上皮細(xì)胞β-防御素-9基因表達(dá)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012,04(6): 634-641.

[4] 王玉愛，劉志杰.人β防御素-2抗唾液支原體活性研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),20l0，16(10): 10-11.

[5] 李明，馬嫚，李巖，等.補(bǔ)中益氣湯對(duì)小鼠腸道HBD-2表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,05(6): 511-514.

[6] 陳潔，陳莉莉.腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞β-防御素的體外表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究,2012,50(6): 9431-9436.

[7] 沈楨巍，方路，姜敏敏，等.β防御素2對(duì)大鼠肺部炎癥細(xì)胞因子的影響[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，08(1): 17-20.

Effect of adenosine triphosphate on expression of endogenousβ-defensin 2 in mice

LIUAi-hong1,SHENZhen-wei2，LEIHan3

(1. Tongji University, Medical College, Shanghai 200092, China; 2. East Hospital, Tongji University ICU, Shanghai 200120， China；3. East Hospital, Tongji University Department of respiration, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the effect of adenosine triphosphate(ATP) on expression of endogenous β-defensin-2(β-BD-2) in mince. Methods Sixty BABL/c mice were divided into control group(N=30) and test group (T=30). Mice in test group received tail intravenous injection of 0.12mg/10g ATP, and the same volume of normal saline was given to mice in control group. Ten mice were sacrificed at 12h(T1), 24h (T2) and 36h (T3) after injection in both groups, respectively; and the lung samples were collected. The expression of mβ-BD-2 mRNA and protein in lung tissue was detected by RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. Results Compared with control group, the expression of mβ-BD-2 mRNA was increased after ATP administration in test group. In test group the expression of β-BD-2 mRNA was higher at T2 than that at T1 and also higher that in control group at T2(bothP<0.01). There was no difference in expression of mβ-BD-2 mRNA between T2 and T3 in test group(P>0.01). Immunohistochemistry demonstrated that mβ-BD-2 protein was up-regulated at T2, the protein levels at T2 were higher than those at T1 and T3(P<0.01). Conclusion The expression of endogenous mβ-BD-2 mRNA can be up-regulated by ATP, and the effects vary at different time points of ATP administration.

adenosine triphosphate； βdefense element； mRNA

10.16118/j.1008-0392.2015.03.002

2014-06-02

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(20124Y113);浦東新區(qū)衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(PW2011A-7)

劉愛紅(1977—)，女，主治醫(yī)師，學(xué)士.E-mail: lah818@sohu.com

雷 撼.E-mail: leihan@sina.com

R 758.63

A

1008-0392(2015)03-0006-04