張 蘊(yùn)，吳羽楠，李鉆芳，林如輝，陶 靜，陳立典

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122)

腦卒中是危害中老年人身體健康的主要疾病之一，目前的發(fā)病率達(dá)120 ～180/10 萬，患病率達(dá)400 ～700/10 萬。腦卒中后所帶來的各種功能障礙也嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量和生命質(zhì)量，其中認(rèn)知功能障礙較為常見［1］，大約26%的卒中患者會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的認(rèn)知障礙［2］。在臨床治療方面，目前主要以改善腦循環(huán)、營養(yǎng)腦細(xì)胞并配合康復(fù)訓(xùn)練等手段為主，治療周期長，療效也不明顯［3，4］，而電針對卒中后認(rèn)知功能障礙的治療具有大量的臨床經(jīng)驗(yàn)和穩(wěn)定的臨床療效，但是缺乏具體的作用機(jī)制的研究。本研究觀察針刺經(jīng)驗(yàn)效穴“神庭”、“百會(huì)”兩穴對模型大鼠腦組織抵抗缺血損害的作用，并進(jìn)一步觀察該方法對大鼠認(rèn)知功能的改善情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證為SYXK2012-003，共60 只成年的雄性清潔級SD 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由飲食和飲水，其濕度控制在50% ～70%之間，恒溫22℃，其光照為早8:00 ～晚20:00，體重平均在(270 ±20)g。

1.2 主要儀器、器械及試劑

儀器:①手術(shù)儀器:剪刀、彎鑷、顯微鑷、顯微剪、動(dòng)脈血管夾、止血鉗、持針器(唐山先鋒醫(yī)療器械有限公司);②Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);③倫牌SDZ-II 電針儀、0.5 寸華佗牌不銹鋼毫針(北京瑞康眾成科技有限公司)。

試劑:10%水合氯醛，碘伏，酒精。

1.3 動(dòng)物模型的制備

在SPF 級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，大鼠稱重后，按照3 ml/kg的劑量，用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，四肢和頭部固定，然后將頸部正中的皮膚消毒、備皮、剪開，將頸總動(dòng)脈徹底暴露，沿著頸總動(dòng)脈向上分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的主干及分支，結(jié)扎頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處，血管夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處，然后結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端，并在離結(jié)扎1 ～2 mm 處剪一小口，將線拴插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開血管夾，其插入的深度大約距頸內(nèi)、外動(dòng)脈的分叉處18 ～22 mm，最后固定線栓，手術(shù)完成后將其放在木屑中并溫水保溫，密切觀察其變化，2 h 后將線栓緩慢退出。假手術(shù)組僅將動(dòng)脈分離，然后縫合。

大鼠醒后，參照Longa 法，通過神經(jīng)行為學(xué)的評分，判斷造模的情況，將不符合要求的予以剔除。制得模型組、假手術(shù)組、電針組各20 只。

1.4 干預(yù)措施

假手術(shù)組和模型組:不予任何治療。給予同等條件的喂養(yǎng)。

電針組:參照大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［5］，選取神庭、百會(huì)穴進(jìn)行針刺，采用疏密波，頻率1 ～20 Hz，每次30 min，1 次/日，療程為1 周。

1.5 檢測方法與觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)行為學(xué)測試 采用Longa 法對大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行測試，從造模后第1 天開始，直至第7 天處死，以觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能的變化。造模后2 h 拔完魚線，直接進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的評分，參照Longa 法:①0分，無神經(jīng)缺失的癥狀;②1 分，不能完全伸展對側(cè)前爪;③2 分，向右側(cè)側(cè)轉(zhuǎn)圈;④3 分，向?qū)?cè)傾倒;⑤4分，神經(jīng)缺失癥狀嚴(yán)重，不能行走。其中，0 分、4 分判斷為造模未成功，并予以剔除，從造模后第1 天開始，1次/日，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)的評分(注:每日電針完后進(jìn)行)，直至大鼠處死。

1.5.2 腦梗死體積觀測 采用TTC 染色后觀察大鼠腦梗死體積的變化。TTC 染色:①按照3 ml/kg 的劑量，用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉;②充分暴露心臟后用生理鹽水進(jìn)行灌注，直至眼睛發(fā)白;③斷頭取腦，要求速度快并且保持大腦的完整性;④放在專門的腦槽置于-20°冰箱中速凍15 min;⑤切片:第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，每隔2 mm 切1 片，共切6片;⑥將切片放入2%TTC 染液中，用錫箔紙蓋住避光，然后放在恒溫37°的水浴鍋中15 min，注意要不時(shí)翻動(dòng)腦片，使之染色均勻［6］。

1.5.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 利用水迷宮對大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)、記憶功能變化。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn):為了防止大鼠傷口感染，各組大鼠均從造模后第2 天進(jìn)行測試，每次于電針干預(yù)完后進(jìn)行。水迷宮為一個(gè)圓形的水池，直徑120 cm，高度50 cm，主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將其水溫控制在24 ～28℃之間，水深定在30 cm，水池壁上有4 個(gè)等距離點(diǎn)，將其劃分4 個(gè)象限。平臺(tái)擱置在以上任意象限的中央即可，該平臺(tái)的直徑為5 cm，高度28 cm，，距離水面2 cm 即可，水池周邊的光線不宜太亮，不要放置明顯的參照物［7］。

①定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation):通過大鼠逃避潛伏期，判斷其學(xué)習(xí)記憶的能力，所謂逃避潛伏期是指大鼠在90 s 內(nèi)找到平臺(tái)，并在平臺(tái)上能停留3 s，如果90 s 內(nèi)沒有完成，則逃避潛伏期的時(shí)間按照90 s 計(jì)算，然后將其放置平臺(tái)10 s，讓其熟悉，通過此方式每天進(jìn)行2 次訓(xùn)練，持續(xù)5 天。每次訓(xùn)練時(shí)將其從4 個(gè)不同的象限依次放入，每個(gè)象限的入睡點(diǎn)固定，間隔5 min，然后計(jì)算4 個(gè)象限平均潛伏期及平均路程。

②空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe):通過大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)，判斷其空間記憶的能力，即在定位航行實(shí)驗(yàn)后的第6 天上午，將平臺(tái)撤掉，然后把大鼠放入任意入水點(diǎn)，計(jì)算90 s 內(nèi)大鼠經(jīng)過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)。

1.5.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 利用跳臺(tái)儀的反應(yīng)箱對大鼠進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)、記憶功能變化。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)在造模后第7 天電針干預(yù)完之后，將各組大鼠放入跳臺(tái)儀的反應(yīng)箱內(nèi)的銅柵處，使其適應(yīng)3 min，然后接通電源，如果大鼠四肢同時(shí)接觸銅柵，此時(shí)會(huì)遭受電擊(2 s，0.5 mA)，大鼠會(huì)反射性的向安全平臺(tái)區(qū)上跳躍，而當(dāng)大鼠跳下平臺(tái)后會(huì)繼續(xù)遭受電擊，計(jì)算大鼠在3 min內(nèi)遭受的電擊次數(shù)，以此作為判斷大鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)的能力。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完之后將其放回籠中，24 h 之后再將大鼠放置在安全平臺(tái)上，測量3 min 內(nèi)大鼠從平臺(tái)安全區(qū)跳下的時(shí)間，作為大鼠記憶的能力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 分析軟件，統(tǒng)計(jì)描述采用頻數(shù)、均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)推斷計(jì)數(shù)資料3 組之間總體差異的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD 法，方差不齊采用Dunnelt＇s T3 法，P ＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)具有差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

表1 電針對動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

從表1 可以看出，結(jié)果顯示模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)得分處于較高水平，提示神經(jīng)功能缺陷較為嚴(yán)重，而電針組的大鼠行為學(xué)得分逐步降低，顯示經(jīng)過電針治療后，大鼠的神經(jīng)功能缺失逐漸恢復(fù)，部分功能重建改善，使得分降低。

2.2 TTC 染色后觀察大鼠腦梗死體積的變化

從圖1 及表2 結(jié)果中可以看到，在電針治療后，大鼠的腦細(xì)胞梗死體積正在逐步縮小，相對于模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 電針對大鼠腦梗死體積的影響(%)

圖1 大鼠腦梗死體積變化

2.3 定位航行試驗(yàn)大鼠經(jīng)過路程和逃避潛伏期的比較

表3 結(jié)果提示:模型組大鼠所經(jīng)過的路程顯著長于假手術(shù)組，而經(jīng)過治療后，電針組到達(dá)目標(biāo)所需要路程明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05;與模型組比較，bP ＜0.05。

表4 各組大鼠每天逃避潛伏期的比較(單位:s)

2.4 空間探索實(shí)驗(yàn)大鼠穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)

表4 結(jié)果提示:模型組大鼠逃避潛伏期顯著長于假手術(shù)組，而經(jīng)過治療后，電針組耗時(shí)小于模型組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表5 大鼠穿過位置的平臺(tái)的次數(shù)

2.5 跳臺(tái)試驗(yàn)中大鼠電擊次數(shù)與跳下平臺(tái)的時(shí)間

表5 結(jié)果顯示在造模后第7 天，撤去平臺(tái)，測大鼠在90 s 內(nèi)穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)，電針組穿過平臺(tái)位置的次數(shù)明顯多于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表6 跳臺(tái)試驗(yàn)中電針對大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響

表6 顯示術(shù)后第7 天電針結(jié)束后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)幵始前大鼠放入反應(yīng)籠中適應(yīng)3 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為電針組大鼠遭受電擊次數(shù)明顯少于模型組(P ＜0.05)。24 h 后測大鼠從平臺(tái)安全區(qū)跳下時(shí)間，與模型組相比，電針組大鼠跳下平臺(tái)的平均潛伏期明顯延長(P ＜0.05)。

從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，模型大鼠在經(jīng)過電針干預(yù)后，腦梗死的體積逐步縮小，行為能力和記憶能力都在改善，與模型組相比，各項(xiàng)指標(biāo)的差別均有顯著性變化(P ＜0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究用MCAO 模型大鼠，觀察電針神庭、百會(huì)對卒中后認(rèn)知功能障礙大鼠行為學(xué)的影響，其中通過神經(jīng)行為學(xué)的評分，判斷模型成功與否，其標(biāo)準(zhǔn)是將評分2 分(向右側(cè)轉(zhuǎn)圈)或者3 分(向?qū)?cè)傾倒)的MCAO 大鼠納入研究對象，不符合的予以剔除，針刺治療后，筆者發(fā)現(xiàn)造模后前3 天，電針組與模型組相比，P ＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而電針組、模型組與假手術(shù)組相比，P ＜0.05，說明模型是比較成功的，而從造模后第4 天，電針組與模型組相比，P ＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明電針組使大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分降低。

在TTC 染色中，由于TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感復(fù)合物，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)由于脫氫酶活性下降［8］，因此會(huì)呈現(xiàn)蒼白色，利用這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理，可以形象直觀的看見電針是否可以減輕梗死面積，最后經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，可以看見電針組的梗死面積與模型組相比，P ＜0.05，提示電針神庭、百會(huì)可以降低MCAO大鼠的梗死面積，同時(shí)，從以上實(shí)驗(yàn)圖片也可以看出MCAO 的模型還是比較成功的。

在與認(rèn)知相關(guān)的水迷宮實(shí)驗(yàn)中，從大鼠定位航行和空間探索的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以看見模型組、電針組在游泳路程、平均潛伏期上與假手術(shù)組相比都明顯的延長，說明MCAO 模型的確是影響了大鼠的認(rèn)知功能，而電針組在游泳路程、平均潛伏期上與模型組相比又有所縮短，并且P ＜0.05，說明電針的確可以增強(qiáng)卒中后認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，而在大鼠的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，從大鼠遭受的電擊次數(shù)和跳下平臺(tái)的時(shí)間也相應(yīng)的得到了驗(yàn)證，說明電針神庭、百會(huì)可以改善MCAO 后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

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