郭長峰, 彭 滬, 陳遠卓, 陳艷清, 莊育剛, 周書琴

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

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·基礎(chǔ)研究·

Foxp3與突變型p53在食管鱗癌中的表達及意義

郭長峰, 彭 滬, 陳遠卓, 陳艷清, 莊育剛, 周書琴

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

目的 探討Foxp3和突變型p53在食管鱗癌中的表達及其意義。方法 利用免疫組織化學(xué)方法對83例食管鱗癌患者的腫瘤組織標(biāo)本進行Foxp3和突變型p53蛋白檢測，并采用配對t檢驗和K-W檢型對兩種蛋白檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 83例食管鱗癌患者的腫瘤組織中，F(xiàn)oxp3和突變型p53蛋白的陽性表達率分別為59.04%、61.45%。性別和年齡方面，F(xiàn)oxp3和突變型p53表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Foxp3和突變型p53的表達與腫瘤分化程度，浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)；Foxp3和突變型p53的表達呈負相關(guān)(r=-0.474，P<0.01)。結(jié)論 Foxp3和突變型p53的表達與不良預(yù)后關(guān)系密切，可能是預(yù)后不良的預(yù)測因子。

食管鱗癌； Foxp3； 突變型p53

Foxp3作為叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，最初被認為是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的特異性標(biāo)志。野生型p53是一種核蛋白，參與細胞周期調(diào)控，DNA修復(fù)和凋亡誘導(dǎo)，屬于抑癌基因。但在多數(shù)腫瘤中，p53發(fā)生突變，而多數(shù)突變型p53與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療抵抗等有關(guān)[1]。目前，關(guān)于食管癌細胞中Foxp3的表達及與其他腫瘤因子關(guān)系的研究較少。本研究通過免疫組化方法，探討Foxp3與突變型p53在食管鱗癌中的表達及其意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院2005年2月至2011年7月頸段食管鱗癌的手術(shù)切除標(biāo)本83例?；颊呔鶠槭状谓邮苁中g(shù)治療的患者，術(shù)前未行放療、化療及免疫治療，行常規(guī)的影像學(xué)檢查。標(biāo)本均于手術(shù)中取材，置于預(yù)冷的10%中性福爾馬林中固定，用于免疫組織化學(xué)法檢測，經(jīng)醫(yī)院病理醫(yī)師確認病理類型均為食管鱗癌。

1.2 試劑

小鼠抗人Foxp3單克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人p53單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；即用型兔/小鼠通用型免疫組化試劑盒購自DAKO公司。

1.3 方法

新鮮的食管鱗癌手術(shù)組織用10%的中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚4μm。切片脫蠟、水化。采用二步法進行免疫組化染色，高壓鍋修復(fù)法進行抗原修復(fù)(pH 10.0)，用DAB顯色，蘇木精細胞核復(fù)染。正常兔血清代替一抗作為陰性對照，PBS作為空白對照。

1.4 結(jié)果判斷

顯微鏡下觀察良好的組織結(jié)構(gòu)以及清晰的背景細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒反應(yīng)物為陽性，根據(jù)細胞著色強度和陽性細胞百分比確定Foxp3和p53表達的半定量分級： 按細胞著色強度，無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;按陽性細胞百分比，≤10%為0，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分;兩者的乘積，0分為陰性，≥1分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。組間比較滿足正態(tài)性和方差齊時采用配對t檢驗，不滿足條件者采用非參數(shù)K-W檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Foxp3蛋白在食管鱗癌組織中表達

Foxp3蛋白在食管鱗癌實質(zhì)細胞中呈灶性彌漫性分布，主要表達于食管鱗癌細胞中，定位于細胞核(圖1)。頸段食管鱗癌實質(zhì)細胞Foxp3表達的陽性率為59.04%(49/83)。在性別和年齡方面，F(xiàn)oxp3表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在病理分級高、中、低分化組中，陽性率依次降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)；黏膜內(nèi)和淺肌層組的陽性率高于全層組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)；無轉(zhuǎn)移組陽性率高于有轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)，見表1。

圖1 Foxp3在食管鱗癌組織中的表達Fig.1 Expressions of Foxp3 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues (A×200，B×400)

2.2 p53蛋白在食管鱗癌組織中表達

p53蛋白主要表達于食管鱗癌細胞中，定位于細胞核(圖2)。頸段食管鱗癌實質(zhì)細胞p53表達的陽性率為 61.45%(51/83)。在性別和年齡方面，F(xiàn)oxp3表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在病理分級高、中、低分化組中，陽性率依次升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；黏膜內(nèi)和淺肌層組陽性率低于全層組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.074>0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)，見表1。

圖2 p53在食管鱗癌組織中的表達Fig.2 Expressions of p53 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues (A×200，B×400)

臨床病理特征Foxp3(n=83)p53(n=83)+(%)-(%)P值+(%)-(%)P值性別 男37(44.6%)21(25.3%)0.17935(42.2%)23(27.7%)0.754 女12(14.5%)13(15.7%)16(19.3%)9(10.8%)年齡/歲 ≤5024(28.9%)15(18.1%)0.66327(32.5%)12(14.5%)0.170 >5025(30.1%)19(22.9%)24(28.9%)20(24.1%)病理分級 高分化19(22.9%)6(7.2%)0.0078(9.6%)17(20.5%)0.001 中分化23(27.7%)13(15.7%)25(30.1%)11(13.3%) 低分化7(8.4%)15(18.1%)18(21.7%)4(4.8%)浸潤深度 黏膜/淺肌層29(34.9%)5(6.0%)<0.000117(20.5%)17(20.5%)0.074 全層20(24.1%)29(34.9%)34(41.0%)15(18.1%)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無34(41.0%)7(8.4%)<0.000119(22.9%)22(26.5%)0.005 有15(18.1%)27(32.5%)32(38.6%)10(12.0%)

2.3 食管鱗癌中Foxp3和p53表達相關(guān)性分析

83例食管鱗癌患者中，F(xiàn)oxp3陽性表達49例，其中p53陽性表達17例；在34例Foxp3陰性患者中，有23例p53陽性表達。用Spearman法進行相關(guān)性檢驗，在食管鱗癌中Foxp3與p53表達呈負相關(guān)(r=-0.474，P<0.001)，見表2。

表2 食管癌組織中Foxp3和p53表達相關(guān)性分析

3 討 論

2001年，Brunkow等[2]首次報道了叉頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)其對Treg的發(fā)育及抑制功能獲得起著重要的作用，是Treg獲得免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。以往大部分的研究[5]都聚焦到Foxp3的表達和調(diào)節(jié)Treg細胞。目前，許多研究顯示Foxp3在腫瘤細胞上有所表達，并且對于調(diào)控局部免疫反應(yīng)和促進腫瘤的免疫逃逸發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但是因為關(guān)于Foxp3在腫瘤細胞上的功能研究甚少，許多問題還存在著爭議。即使在同一種腫瘤上，一些研究結(jié)果仍然是不一致的。目前為止，關(guān)于腫瘤細胞高表達Foxp3影響腫瘤發(fā)展的機制仍然不是很清楚。Hintz等[6]報道顯示，在胰腺癌中Foxp3表達陽性的癌細胞可能具有Treg樣的免疫抑制功能，從而逃避死亡。另一方面，Merlo等[7]報道提示，F(xiàn)oxp3上調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，而不是免疫抑制反應(yīng)。還有一些研究[8]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，F(xiàn)oxp3作為一些特異性的乳腺癌原癌基因的聯(lián)合抑癌基因。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的一種基因，目前研究較為成熟。它的表達能誘導(dǎo)生長抑制和細胞凋亡，其功能缺失或基因突變將導(dǎo)致細胞周期失去正常的調(diào)控，進一步導(dǎo)致細胞生長失去控制，促使惡性腫瘤形成。p53基因分為野生型和突變型兩種，其產(chǎn)物也有野生型和突變型。野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘，并具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用[1]。突變型p53蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期延長，可被免疫組化方法檢測出來。Yamasaki等[9]在食管癌中的研究提示,突變型p53損害其DNA結(jié)合性和轉(zhuǎn)錄因子功能,發(fā)揮癌基因的作用,能導(dǎo)致細胞周期失控、腫瘤侵襲性增強,加速腫瘤的進程。隨著人們對p53基因信號通路與腫瘤發(fā)生機制研究的深入，尤其是綜合探究信號通路中關(guān)鍵基因多態(tài)位點與腫瘤發(fā)生、分期及預(yù)后轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，將極有助于揭示腫瘤病因，并為特異性腫瘤標(biāo)志物的產(chǎn)生提供實證，從而也為腫瘤的早期診斷及臨床特異性的治療奠定堅實可靠的基礎(chǔ)。

在本研究中，F(xiàn)oxp3蛋白在食管鱗癌組織中表達陽性率為59.04%(49/83)，F(xiàn)oxp3表達與腫瘤分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；突變型p53蛋白在食管鱗癌組織中表達陽性率為61.45%(51/83)，突變型p53表達與食管鱗癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高分化的癌組織中p53低表達,而在低分化的癌組織中p53是高表達的，這個結(jié)果與Murtaza等[10]報道一致。可見，F(xiàn)oxp3和p53對于食管鱗癌預(yù)后的重要影響，兩者之間的相關(guān)性研究對于揭示食管鱗癌的病因以及早期診斷和治療都有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中Foxp3的表達與突變型p53的表達水平呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)性。Jung等[11]報道，正常野生型p53腫瘤抑制活性對于腫瘤細胞Foxp3的表達至關(guān)重要，F(xiàn)oxp3對于p53介導(dǎo)的細胞生長抑制起到重要作用，而不是影響細胞凋亡。Won等[12]報道，腫瘤細胞來源的Foxp3的表達與p53介導(dǎo)的細胞周期阻滯相關(guān)，同時也依賴于正常野生型p53的調(diào)節(jié)功能。以上結(jié)果初步提示食管鱗癌腫瘤細胞表達的Foxp3可能是潛在的抑癌基因，p53基因的突變影響了Foxp3的表達。Foxp3和p53一定程度上可作為預(yù)后不良預(yù)測因子。Foxp3是否可能成為食管鱗癌治療的新靶標(biāo)，仍需要進一步的深入探討。

[1] Muller PA, Vousden KH. Mutant p53 in cancer： new functions and therapeutic opportunities[J]. Cancer Cell， 2014,25(3)： 304-317.

[2] Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, et al. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin,results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse[J]. Nat Genet， 2001,27(1)： 68- 73.

[3] Hori S, Sakaguchi. Foxp3： a critical regulator of the development and function of regulatory T cells[J]. Microbes Infect, 2004,6(8)： 745-751.

[4] Chen W, Jin W, Hardegen N, et al. Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by TGF-β induction of transcri-ption factor Foxp3[J]. J Exp Med, 2003,198(12)： 1875- 1886.

[5] Ziegler SF, Buckner JH. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation[J]. Microbes Infect, 2009,11(5)： 594-598.

[6] Hinz S, Pagerols-Raluy L, Oberg HH, et al. Foxp3 expression in pancreatic carcinoma cells as a novel mechanism of immune evasion in cancer[J]. Cancer Res, 2007,67(17)： 8344-8350.

[7] Merlo A, Casalini P, Carcangiu ML, et al. Foxp3 expression and overall survival in breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2009,27(11)： 1746-1752.

[8] Zuo T, Wang L, Morrison C, et al. Foxp3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene[J]. Cell, 2007,129(7)： 1275-1286.

[9] Yamasaki M, Miyata H, Fujiwara Y, et al. p53 genotype predicts response to chemotherapy in patients with squamous cell carcinoma of the esophagus[J]. Ann Surg Oncol, 2010,17(2)： 634-642.

[10] Murtaza I, Mushtaq D, Margoob MA, et al. A study on p53 gene alterations in esophageal squamous cell carcinoma and their correlation to common dietary risk factors among population of the Kashmir valley[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(25)： 4033-4037.

[11] Jung DJ, Jin DH, Hong SW, et al. Foxp3 expression in p53-dependent DNA damage responses[J]. J Biol Chem, 2010,285(11)： 7995-8002.

[12] Won KY, Kim HS, Sung JY, et al. Tumoral Foxp3 has potential oncogenic function in conjunction with the p53 tumor suppressor protein and infiltrated Tregs in human breast carcinomas[J]. Pathol Res Pract, 2013,209(12)： 767-773.

Expression of Foxp3 and mutated p53 in esophageal squamous cell carcinomas and its significance

GUOChang-feng,PENGHu,CHENYuan-zhuo,CHENYan-qing,ZHUANGYu-gang,ZHOUShu-qin

(Dept. of Emergency, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the expressions of Foxp3 and mutated p53 in esophageal squamous cell carcinoma and its significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Foxp3 and mutated p53 in tissues of 83 cases with esophageal squamous cell carcinoma. The differences of two proteins were tested usingttest for parametric data or usingK-Wtest for nonparametric data. Results Foxp3 and mutated p53 expressions were positive in 59.0%(71/83) and 61.5%(51/83) cases of esophageal squamous cell carcinoma, respectively. The expressions of Foxp3 and mutated p53 were significantly correlated with differentiation, depth of tumor infiltration and lymph node metastasis (P<0.01), but not correlated with gender and age of patients (P>0.05). There was negative correlation between the expressions of Foxp3 and mutated p53 in esophageal squamous cell carcinoma with a Spearman correlation coefficient of -0.474(P<0.01). Conclusion The expression of Foxp3 and p53 protein is correlated with the poor prognosis and may serve as a prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma.

esophageal squamous cell carcinoma; Foxp3; mutational p53

10.16118/j.1008-0392.2015.01.007

2014-07-31

郭長峰(1985—)，男，主治醫(yī)師，碩士研究生.E-mail： shgcf2007@sina.com

彭 滬.E-mail： 18917683122@189.cn

R 735.1

A

1008-0392(2015)01-0029-04