余 飛, 蔡海東, 李 丹, 馬雨水, 袁雪宇, 呂中偉

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

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·基礎(chǔ)研究·

核素介導(dǎo)生長抑素類似物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外殺傷作用

余 飛, 蔡海東, 李 丹, 馬雨水, 袁雪宇, 呂中偉

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

目的 觀察核素介導(dǎo)生長抑素類似物對非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)細(xì)胞的體外殺傷作用。方法 MTT法測定核素介導(dǎo)生長抑素類似物對人肺癌細(xì)胞A549和SPC-A1增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證核素介導(dǎo)生長抑素類似物對腫瘤侵襲的影響。結(jié)果 2～6d內(nèi)，核素介導(dǎo)生長抑素類似物對A549和SPC-A1細(xì)胞的抑制率隨時間延長明顯增加。經(jīng)核素介導(dǎo)生長抑素類似物處理48h后，A549和SPC-A1細(xì)胞凋亡率分別為23.1%和22.6%。與對照組相比，核素介導(dǎo)生長抑素類似物處理過的A549和SPC-A1細(xì)胞侵入膠原的數(shù)量減少了約1/3。結(jié)論 核素介導(dǎo)生長抑素類似物具有誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的作用，這可能為NSCLC的放射治療提供了新的思路。

生長抑素類似物； 核素介導(dǎo)； 非小細(xì)胞肺癌； 體外殺傷

大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer， NSCLC)患者在進(jìn)入晚期之后才被發(fā)現(xiàn)，僅有20%可接受手術(shù)治療，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率超過50%[1]。一線含鉑兩藥聯(lián)合方案是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但治療有效率僅為30%左右，而且接受化療的患者最終都會失效[2]，即使采用同步放化療，患者長期生存仍較差[3]。以放射性粒子植入為基礎(chǔ)的綜合治療只是姑息治療手段，不是根治手段，且有氣胸、出血、疼痛、低熱、放射性損傷，包括急性放射性肺炎和放射性肺纖維化等并發(fā)癥[4]。因此，應(yīng)開發(fā)出一些通過調(diào)節(jié)異常信號通路而直接靶向于腫瘤細(xì)胞的新型治療藥物，在減少不良反應(yīng)的同時，為患者帶來更佳的療效。

本研究觀察核素介導(dǎo)生長抑素類似物(188Re-MAG3-depreotide)對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外殺傷和荷瘤裸鼠腫瘤放射性核素靶向治療作用，為實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌受體介導(dǎo)治療提供新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

188W/188Re發(fā)生器購自上?？婆d藥業(yè)公司；CRC-15R型放射性核素活度計(jì)購自美國Capintec公司；Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司；SN-695B型放免γ測量儀購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；人肺癌細(xì)胞株A549和SPC-A1由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。裸鼠20只由上海實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，3～4周齡，平均體質(zhì)量 20～25g，用于建立NSCLC腫瘤模型。

1.2 方法

1.2.1188Re標(biāo)記MAG3-depreotide及標(biāo)記率和放化純的測定 將MAG3-depreotide溶于醋酸胺溶液，逐滴加入酒石酸鹽溶液和氯化亞錫溶液，最后加入200μl的740mBq/L188ReO4洗脫液，反應(yīng)液在室溫下放置15～30min后，測定標(biāo)記率。標(biāo)記物經(jīng)過Sephadex G25柱純化，分步收集，確定洗脫峰位置，測定放化純度。

1.2.2 A549和SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌細(xì)胞株A549加用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化傳代，約1周后腫瘤細(xì)胞的總體數(shù)量可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。將處于對數(shù)生長期的NSCLC細(xì)胞株SPC-A1置于含15%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長到80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2次后，經(jīng)0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞混懸液，以2×105/孔的濃度接種于48孔培養(yǎng)基中生長24h。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天細(xì)胞生長至單層接觸融合時，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次后備用。

1.2.3188Re-MAG3-depreotide對A549和SPC-A1細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 分別收獲對數(shù)生長中期、生長狀態(tài)良好的NSCLC細(xì)胞株A549和SPC-A1，然后加入200μl的RPMI-164培養(yǎng)基和100μl的37mBq/L188Re-MAG3-depreotide(終濃度為12.3mBq/L)，在37℃孵育60min，每組設(shè)8個平行孔。分別從第 2～6天采用MTT法檢測細(xì)胞生長情況。每天取出一塊培養(yǎng)板，向每孔加入新鮮配制的MTT液(5mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去孔內(nèi)上清液,每孔加人二甲基亞砜150μl,振蕩10min,結(jié)晶物充分溶解后在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測570nm波長處光密度值(D570)。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，公式為： 抑制率=[(對照組D值-實(shí)驗(yàn)組D值)÷對照組D值]×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 NSCLC細(xì)胞株A549和SPC-A1生長在完全培養(yǎng)基中，以0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，次日加入100μl的37 mBq/L的188Re-MAG3-depreotide(終濃度為12.3mBq/L)，同時設(shè)不加188Re-MAG3-depreotide為空白對照。12h后，去掉加樣的培養(yǎng)基，用完全培養(yǎng)基洗滌2遍，再加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48h，0.25%胰蛋白酶消化，輕輕吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，PBS洗3遍，離心后加入Binding Buffer 200μl 重懸細(xì)胞，單個細(xì)胞懸液先加10μl Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)30min，再加入5μl PI，室溫避光反應(yīng)5min，再加Binding Buffer工作液400μl即可上機(jī)。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell置于24孔培養(yǎng)板中，各加入50μl的上述混合液于上室。將100μl 37mBq/L的188Re-MAG3-depreotide處理過的A549和SPC-A1及其對照細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基制成1×106/ml的細(xì)胞懸液。處理過的細(xì)胞用4℃的pH為7.4的PBS洗滌2次，完全洗脫188Re-MAG3-depreotide。取出上室，用棉拭子擦除未能侵襲的細(xì)胞后，中性甲醛固定30min，常規(guī)H-E染色；于200倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)浸潤細(xì)胞，取平均值進(jìn)行比較。

1.2.6188Re-MAG3-depreotide的毒性及熱原實(shí)驗(yàn) 將標(biāo)記溶液經(jīng)微孔無菌濾膜處理后，微生物學(xué)檢查進(jìn)行需氧菌、厭氧菌和霉菌實(shí)驗(yàn)，熱源檢查： 鱟試驗(yàn)參照《中華人民共和國藥典》(1995年版)附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1188Re-MAG3-depreotide的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度

在生理鹽水的展開劑Ⅰ中，膠體和標(biāo)記物位于原點(diǎn)，而游離188Re則展開至前沿；在85%酸化乙醇(pH 3.5)中，膠體停留在原點(diǎn)，而游離188Re和標(biāo)記物遷移至展開劑前沿。新華Ⅰ號紙層析測定188Re標(biāo)記MAG3-depreotide標(biāo)記物的標(biāo)記率>80%，比活度達(dá)到200GBq/mmol，放化純可達(dá)到90%，表明標(biāo)記物可以較好地滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 MTT法測定188Re-MAG3-depreotide對細(xì)胞增殖的影響

2～6d內(nèi)，標(biāo)記物對A549和SPC-A1細(xì)胞在的抑制率如表1所示，可見隨時間延長，抑制率均明顯增加，在第6天時達(dá)到最大，為50%～60%。188Re-MAG3-depreotide對A549和SPC-A1細(xì)胞的抑制率未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但該標(biāo)記物具有明顯抑制體外培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞生長增殖的作用。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測

A549和SPC-A1細(xì)胞經(jīng)188Re-MAG3-depre-otide處理48h后，收集5×105～5×106個細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，然后立即用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果見圖1。AnnexinV-FITC用Ⅰ雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)可以將實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分為四個群，Q1群： AnnexinV-FITCˉ、Pl+，代表機(jī)械損傷細(xì)胞；Q2群： AmiexinV-FITC+、PIˉ，為早期凋亡細(xì)胞；Q3群： AnnexinV-FITCˉ、Plˉ，代表活細(xì)胞；Q4群： AnnexinV-FITC+、PI+為凋亡晚期或壞死細(xì)胞。結(jié)果表明，A549和SPC-A1細(xì)胞經(jīng)188Re-MAG3-depreotide處理48h后均表現(xiàn)出了明顯的凋亡，凋亡率分別為23.1%和22.6%。

表1 標(biāo)記物對A549和SPC-A1細(xì)胞各時間點(diǎn)抑制率

細(xì)胞2d3d4d5d6dA54913.62±4.7523.48±7.1331.05±6.4342.17±7.8850.32±9.20SPC-A115.29±4.8727.26±5.1839.03±8.6550.01±6.3959.44±7.92

圖1 Annexinv-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果Fig.1 Annexinv-FITC/PI double labeling flow cytometry for detection of cell apoptosis

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

188Re-MAG3-depreotide處理過的A549和SPC-A1細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明，處理組細(xì)胞侵襲力明顯減弱，和其對照組相比，侵入膠原的細(xì)胞數(shù)量減少了約1/3(P<0.05)，見圖2。

圖2 A549和SPC-A1細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Fig.2 Transwell assay for A549 and SPC A1 cells

3 討 論

188Re與99mTc同屬Ⅶ族元素，化學(xué)性質(zhì)相近，標(biāo)記多種放射性藥物的可能性更大，應(yīng)用范圍更廣。將188Re標(biāo)記于某些特異性分子上進(jìn)行腫瘤內(nèi)照射治療，可以提高治療腫瘤的靶向性。188Re是理想的治療用放射性核素，其半衰期為16.7h，可以發(fā)射最大能量為2.12 MeV的β射線。188Re發(fā)射的β射線能量適中，組織內(nèi)照射射程短，最大組織射程11mm，95%的β射線在4mm范圍內(nèi)被吸收，對周圍組織損傷小，特別適用于內(nèi)照射治療；188Re同時還發(fā)射0.155 MeV的γ射線用于顯像，可進(jìn)行核素的生物學(xué)分布情況、輻射劑量及藥代動力學(xué)研究。188Re發(fā)射的β射線電離輻射能力強(qiáng)，表面劑量高，梯度劑量明顯，直接引起生物大分子的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；使腫瘤組織遭受損害，導(dǎo)致細(xì)胞繁殖能力喪失、代謝紊亂失調(diào)、細(xì)胞衰老或死亡等生物效應(yīng)；還可電離小分子產(chǎn)生過氧化氫等氧自由基，間接加速細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的。利用188Re及其標(biāo)記物進(jìn)行腫瘤內(nèi)照射治療的機(jī)制正是基于以上188Re所具有的物理特性及生物學(xué)作用[5]。

研究[6]發(fā)現(xiàn)，188Re能誘導(dǎo)乳腺癌ER-75-30、前列腺癌PC-3等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)和生化特征變化。邊惠潔等[7]探討188Re內(nèi)照射對肝癌細(xì)胞HCC的細(xì)胞周期阻斷及誘導(dǎo)凋亡作用，結(jié)果顯示188Re導(dǎo)致的HCC細(xì)胞死亡具有典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。以上研究結(jié)果表明，188Re具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和直接殺傷癌組織的作用，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)用188Re-MAG3-depreotide對NSCLC細(xì)胞株進(jìn)行了放射性治療，發(fā)現(xiàn)188Re-MAG3-depreo-tide抑制了NSCLC細(xì)胞株A549和SPC-A1的增殖和侵襲，表明188Re-MAG3-depreotide具有誘導(dǎo)NSCLC凋亡的作用，為NSCLC的放射治療提供了新的思路。

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Nuclide-mediated somatostatin analogues induces apoptosis of non-small cell lung cancer cellsinvitro

YUFei,CAIHai-dong,LIDan,MAYu-shui,YUANXue-yu,LüZhong-wei

(Dept. of Nuclear Medicine, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of nuclide-mediated somatostatin analogues on non-small cell lung cancer (NSCLC) cellsinvitro. Methods Cultured NSCLC A549 and SPC-A1 cells were treated with nuclide-mediated somatostatin analogues. Cell proliferation was determined by MTT method, cell apoptosis was detected by flow cytometry, and cell invasion ability was measured by Transwell migration assay. Results Nuclide-mediated somatostatin analogues inhibited proliferation of A549 and SPC-A1 cells in a time-dependent manner within 2-6 d. The apoptosis rates of A549 and SPC-A1 cells treated by nuclide-mediated somatostatin analogues for 48h were 23.1% and 22.6%, respectively. Transwell assay showed that the number of migrant A549 and SPC-A1 cells after treatment was decreased to one third. Conclusion Nuclide-mediated somatostatin analogue induces apoptosis, inhibits proliferation and invasion of NSCLC A549 and SPC-A1 cells.

somatostatin analogues; nuclide mediated; non-small cell lung cancer; killerinvitro

10.16118/j.1008-0392.2015.01.003

2014-08-19

國家自然科學(xué)基金(81301993)

余 飛(1978—)，男，副主任醫(yī)師，博士.E-mail： yufei021@sina.com

呂中偉.E-mail： shtjnmd@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2015)01-0009-04