趙 敏, 范秋淋, 孫奮勇, 陳春球, 李 智

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072； 2. 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215000； 3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072； 4. 上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 200090)

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·基礎研究·

屋塵螨提取液在BALB/c小鼠氣道炎癥中的作用

趙 敏1, 范秋淋2, 孫奮勇1, 陳春球3, 李 智4

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072； 2. 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215000； 3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072； 4. 上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 200090)

目的 比較3種屋塵螨提取液(house dust mite extract, HDM)對BALB/c小鼠氣道炎癥表型的影響，并分析其可能的原因。方法 BALB/c小鼠于實驗第0、7、14、21、28、35天進行PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)滴鼻。采用頭體積描記法測量小鼠的氣道反應性；對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BAL)進行細胞計數(shù)和分類；ELISA法檢測BAL中CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量及血清總IgE；對肺組織PAS染色后進行病理學觀察。結(jié)果 HDM1誘導了以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主的混合型氣道炎癥；HDM2誘導的小鼠氣道炎癥以中性粒細胞升高為主；HDM3僅誘導了微弱的小鼠氣道炎癥反應，未見中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的顯著增加。3種HDM均引起B(yǎng)AL中CXCL1蛋白水平的升高，并伴隨著高腳杯細胞增生等病理組織學改變。結(jié)論 不同來源的HDM可能與不同類型的小鼠氣道炎癥相關。

屋塵螨提取液； 氣道炎癥； 支氣管肺泡灌洗液

house dust mite extract; airway inflammation; bronchoalveolar lavage fluid

屋塵螨提取液(house dust mite extract, HDM)是目前常用來構(gòu)建小鼠哮喘模型的致敏原，它由蛋白質(zhì)和肽等不同成分組成，并具有蛋白酶、結(jié)合蛋白等多種生物學功能，其中Der p(Dermatophagoidespteronyssinus)1和Der p 2被認為是最主要的致敏原[1]。由于Der p在不同的HDM中含量不盡相同，如Der p 1在HDM1(Allergopharma公司)中的含量為4.5%，在HDM2(Greer實驗室)中的含量僅為1.4%，Der p 2亦如此。因而，不同來源的HDM可能對小鼠具有不同的致敏作用。本研究比較了3種不同來源的HDM(HDM1、HDM2、HDM3)對BALB/c小鼠氣道炎癥表型的影響，并分析其可能的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于德國Harlan Winkelmann中心，所有小鼠均在無致病菌環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

HDM1、HDM2或HDM3情況見表1。小鼠CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-17試劑盒購自美國R&D Systems公司；小鼠IL-5、IFN-γ、IL-10抗體及IgE ELISA試劑盒購自美國BD Pharmingen公司；CASY?TT細胞計數(shù)儀購自德國Sch?rfe System公司；Sunrise酶標儀購自德國Tecan公司；Cytocentrifuge Cytospin 3離心機購自英國Shandon公司；Centrifuge Megafuge 1.0R離心機購自德國Heraeus公司；Olympus顯微鏡購自日本Olympus公司。

表1 HDM數(shù)據(jù)表

1.3 動物分組及處理

BALB/c小鼠20只，隨機分為4組： PBS陰性對照組(PBS)、HDM1組、HDM2組、HDM3組，每組5只。于實驗第0、7、14、21、28、35天，各組小鼠接受50μl PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)滴鼻。實驗第36天，測量小鼠的氣道反應性(airway reactivity, AR)。實驗第37天，將小鼠處死后采集標本進行檢測。

1.4 氣道反應性測量

采用頭體積描記法測量小鼠的氣道反應性。結(jié)果記錄為Mch 50(mg/ml)，表示引起呼氣中段流量基線水平(baseline midexpiratory airflow)下降50%的乙酰甲膽堿濃度。

1.5 BAL細胞分類計數(shù)及細胞因子檢測

小鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，仰臥固定，剪開氣管，氣管針插管，注入1ml預冷的含蛋白酶抑制劑的PBS液，進行支氣管肺泡灌洗，灌洗3次。4℃，離心半徑10cm，1200r/min,離心10min，收集上清液獲得BAL，-80℃保存。用含1% BSA的PBS液1ml重懸，使用CASY?TT 細胞計數(shù)儀測量細胞總數(shù)后，取50μl重懸液作1∶200稀釋，經(jīng)Cytocentrifuge Cytospin 3離心制備細胞涂片，吉姆薩染色，鏡下分類計數(shù)。采用ELISA法檢測BAL中趨化因子和細胞因子CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量，操作按說明書進行。

1.6 血清總IgE檢測

經(jīng)小鼠腋靜脈采集靜脈血0.8ml，于室溫下靜置1h后。4℃，離心半徑10cm，2000r/min,離心10min，留取血清。采用ELISA法檢測血清總IgE，操作按說明書進行。

1.7 肺組織病理學觀察

結(jié)扎支氣管，切取左肺組織，置6%福爾馬林液固定過夜，石蠟包埋后連續(xù)5μm切片，PAS染色。鏡下觀察肺組織病理學變化，使用CAST系統(tǒng)計算高腳杯細胞的百分比和黏液分泌物的含量，操作按說明書進行。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同HDM致敏原引起的氣道炎癥反應

鼻滴HDM1、HDM2或HDM3引起小鼠氣道不同程度的白細胞募集。與PBS組比較，HDM1組小鼠氣道可見白細胞的大量浸潤(P<0.05)，主要由中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的增多引起；HDM2組小鼠氣道可見白細胞和中性粒細胞的數(shù)目顯著增加(P<0.01)，嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)目未發(fā)生明顯改變；HDM3組小鼠氣道僅發(fā)生微弱的炎癥反應。3種HDM致敏原均未引起小鼠氣道反應性的顯著改變(圖1)。

圖1 3種HDM致敏原在小鼠模型中引起的氣道炎癥和氣道反應性Fig.1 Airway inflammation and airway reactivity induced by 3 different HDM in a mouse model注： *P<0.05, **P<0.01

2.2 BAL液中CXCL1的蛋白水平變化

與PBS組比較，HDM1、HDM2和HDM3組BAL液中CXCL1的蛋白水平顯著升高(P<0.01)，3組間差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。各組小鼠中CXCL2、CCL11、IFN-γ、IL-5、IL-10和IL-17的含量均低于檢測下限。

2.3 HDM致敏原未引起血清總IgE含量的改變

小鼠經(jīng)HDM1、HDM2或HDM3致敏后，血清總IgE含量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4 肺組織中高腳杯細胞和黏液分泌的變化

經(jīng)PAS染色后，PBS組小鼠肺組織切片未見明顯病理改變，各級支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則且完整，小支氣管及血管周圍無炎性細胞浸潤，支氣管管壁黏膜完整無斷裂及脫落。HDM1、HDM2和HDM3組肺組織切片小支氣管及血管周圍均見明顯的炎性細胞浸潤，支氣管上皮細胞部分斷裂及脫落(圖4)。與PBS組比較，HDM組高腳杯細胞增生顯著增多(P<0.05)，3組間差異無統(tǒng)計學意義(圖5)。

圖2 小鼠BAL中CXCL1的蛋白水平Fig.2 Protein level of CXCL1 in BAL注： *P<0.01

圖3 小鼠血清中總IgE的蛋白含量Fig.3 Protein content of IgE in serum

圖4 肺組織病理學檢測結(jié)果Fig.4 Pathological results in lung tissues

圖5 小鼠肺組織中高腳杯細胞和黏液分泌物的含量Fig.5 Contents of goblet cells and mucin in lung tissuesA： 高腳杯細胞；B： 黏液內(nèi)容物；*P<0.05

3 討 論

HDM是與人類哮喘發(fā)生密切相關的一類過敏原，它廣泛存在于日常生活中，如塵埃、地毯、被褥、床墊、枕芯等。它不同于卵清蛋白，可直接通過呼吸道引起人類哮喘的發(fā)生，且不需要佐劑(如Alum)的輔助，因而備受科學家的關注并得到了較多的研究[2]。但由于在不同的實驗中，受HDM的來源與提取方法、注射途徑與劑量、致敏模式等因素的影響，HDM在動物模型中的致敏效果及其與氣道炎癥表型間的關系目前尚未形成定論。研究[3]表明，鼻滴100μg HDM(與50μg HDM相比)對小鼠氣道炎癥具有更強的誘導作用。本研究比較了由3種不同來源的HDM構(gòu)建的小鼠氣道炎癥模型的特點，發(fā)現(xiàn)來自Allergopharma公司的HDM1誘導了以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主的混合型氣道炎癥；來自Greer實驗室的HDM2誘導的小鼠氣道炎癥以中性粒細胞升高為主；同樣來自Greer實驗室的HDM3僅誘導了微弱的小鼠氣道炎癥反應，未見中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的顯著增加。3種HDM均引起B(yǎng)AL中CXCL1蛋白水平的升高，并伴隨著高腳杯細胞增生等病理組織學改變。

由HDM1、HDM2和HDM3所誘導的炎癥表型間的差異可能歸結(jié)為其致敏原成分(如Der p 1)含量的不同。Post等[4]的研究表明，HDM組分對于上皮細胞重構(gòu)和氣道炎癥起著關鍵性作用。但有關HDM對小鼠氣道炎癥誘導機制的研究目前仍面臨著較多困難，一方面由于HDM提取方法的不同及其組分的復雜性，使得各組分的具體功能難以確定。另一方面則由于它的多變性，來源于同一公司的HDM可能因為批號的不同而具備不同的活性(如本研究中的HDM2和HDM3)。Herman等[5]的體外試驗顯示，Der p 1具有蛋白酶的作用，它通過裂解半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶等酶原物質(zhì)而發(fā)揮活性。而De Alba等[6]的研究結(jié)果則表明，HDM中蛋白酶活性的喪失并未影響其誘導炎癥反應，提示可能存在其他誘導機制。由于不同來源HDM間的固有差異，構(gòu)建小鼠氣道炎癥模型已成為研究HDM的有效方式，并將用于指導哮喘等慢性呼吸道疾病[7]的診斷和治療。

綜上所述，本研究通過對小鼠氣道炎癥模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)不同來源的HDM可能與不同類型的氣道炎癥相關，這可以為進一步開展以HDM為基礎的分子疫苗治療方法提供一些線索。

[1] Stevenson CS, Birrell MA. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance[J]. Pharmacol Ther, 2011,130(2)： 93-105.

[2] Hagner S, Harb H, Zhao M, et al. Farm-derived Gram-positive bacterium Staphylococcus sciuri W620 prevents asthma phenotype in HDM-and OVA-exposed mice[J]. Allergy, 2013,68(3)： 322-329.

[3] 趙敏,李智,于永春.屋塵螨在誘導BALB/c小鼠混合型氣道炎癥中的作用及致病機制探討[J].國際免疫學雜志,2013,36(4)： 319-324.

[4] Post S, Nawijn MC, Hackett TL, et al. The composition of house dust mite is critical for mucosal barrier dysfunction and allergic sensitization[J]. Thorax, 2012,67(6)： 488-495.

[5] Herman J, Thelen N, Smargiasso N, et al. Der p 1 is the primary activator of Der p 3, Der p 6 and Der p 9 the proteolytic allergens produced by the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1840(3)： 1117-1124.

[6] De Alba J, Raemdonck K, Dekkak A, et al. House dust mite induces direct airway inflammationinvivo： implications for future disease therapy？[J]. Eur Respir J, 2010,35(6)： 1377-1387.

[7] 黃漾,邱志宏,魏為利,等.咳嗽敏感性和咳嗽變異性哮喘的比較研究[J].同濟大學學報： 醫(yī)學版,2011,32(1)： 68-72.

Effect of house dust mite extracts on airway inflammation in BALB/c mice

ZHAOMin1,FANQiu-lin2,SUNFen-yong1,CHENChun-qiu3,LIZhi4

(1. Dept. of Clinical Laboratory, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 2. Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 3. Dept. of Gastrointestinal Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 4. Dept. of Clinical Laboratory, Central Hospital of Yangpu District, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate the effect of house dust mite extracts (HDM) on airway inflammation in a murine model. Methods BALB/c mice received an intranasal instillation of PBS or 3 different HDMs (100μg) on the 0, 7th, 14th, 21th, 28th, 35th days. After the final challenge, airway responsiveness (AR), histological changes in the airways and immunological status were examined. Results HDM1 induced the most robust influx of both neutrophils and eosinophils into the airways, HDM2 exerted a stronger effect on the induction of neutrophil airway inflammation, while HDM3 only elicited a very weak inflammatory response. Conclusion Different origins of HDM might contribute to different phenotypes of murine airway inflammation.

10.16118/j.1008-0392.2015.01.001

2014-06-11

國家自然科學基金(81170345)

趙 敏(1978—)，女，主管技師，博士.E-mail： zmin78@163.com

李 智.E-mail： lizhishi2001@163.com

R 562.1

A

1008-0392(2015)01-0001-04