董茂鋒+白冰+唐紅霞+王偉民+趙志輝+韓錚+宋衛(wèi)國(guó)

摘 要 建立了同時(shí)測(cè)定玉米及玉米植株中胺唑草酮及其兩個(gè)代謝物殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品采用乙腈提取，石墨化炭黑（GCB）和C18分散固相萃取凈化，以甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定。在1～1000 μg/L的濃度范圍內(nèi)，3種目標(biāo)化合物的響應(yīng)值與濃度呈良好的線性關(guān)系，在3個(gè)添加水平下，玉米籽粒及植株中胺唑草酮及其代謝物的平均添加回收率為85%～111%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.3%～11.0%。方法定量限（LOQ）為5 μg/kg。采用本方法監(jiān)測(cè)15例市售玉米樣品，樣品中目標(biāo)物均低于方法檢出限。本方法簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，可完全滿足國(guó)外胺唑草酮相關(guān)現(xiàn)行法規(guī)的限量要求。

關(guān)鍵詞 胺唑草酮； 代謝物； 玉米； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

胺唑草酮（Amicarbazone， AMZ）是由美國(guó)拜耳公司研發(fā)，旨在取代高劑量除草劑防治雙子葉闊葉雜草的一類(lèi)三唑啉酮類(lèi)除草劑，主要適用于防治玉米、甘蔗等作物中的闊葉雜草，對(duì)野莧、藜、甘薯屬等雜草具有優(yōu)良防治效果【1】。其觸殺性和特效性決定了它具有較寬的施藥適期，可以方便地選擇種植前或芽前土壤使用，而作為新型低毒農(nóng)藥，其突出的除草效果表現(xiàn)為其用藥量大約僅為阿特拉津的1/3～1/2【2】。胺唑草酮毒理學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)了其是一類(lèi)低毒農(nóng)藥，無(wú)致畸、致癌、致突變作用與再生毒性【3】。目前全球只有美國(guó)對(duì)胺唑草酮制定了最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，限量標(biāo)準(zhǔn)涉及牛肉、豬肉、牛奶、羊及其相關(guān)內(nèi)臟等畜產(chǎn)品和大豆、小麥、棉花等作物，限量范圍在0.01～5.0 mg/kg，其中對(duì)于玉米的最大殘留限量涉及玉米植株（飼料用途）和玉米顆粒，分別為0.8和0.05 mg/kg【4】。根據(jù)美國(guó)EPA對(duì)胺唑草酮的殘留定義，胺唑草酮?dú)埩魬?yīng)包括胺唑草酮及其代謝物DA（N-（1，1-dimeth-ylethyl）-4，5-dihydro-3-（1-methylethyl）-5-oxo-1H-1，2，4-triazole-1-carboxamide）和ISO（N- （1，-dimethylethyl）-4，5-dihydro-3-（1-hydroxy-1-methylethyl）-5-oxo-1H-1，2，4-triazole-1-carboxamide），相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1【4】。針對(duì)胺唑草酮即將在中國(guó)玉米種植中大量使用的預(yù)期，以及EPA關(guān)于胺唑草酮在玉米、玉米植株的殘留限量定義，建立玉米中胺唑草酮及其代謝物的分析方法具有重要意義。但是，目前關(guān)于胺唑草酮的殘留分析方法鮮有報(bào)道。2014年，Peixoto研究了不同光化學(xué)條件對(duì)胺唑草酮在水中降解的影響，結(jié)果顯示DA是其在水中降解的主要產(chǎn)物之一，同時(shí)分析胺唑草酮及其代謝物十分必要。

目前，QuChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）方法已成為農(nóng)藥殘留分析常用的凈化方法之一，其以簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于谷物、蔬菜、水果和環(huán)境樣品中的農(nóng)藥殘留分析【5～18】。QuChERS方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)分散固相萃取和提取溶液的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基質(zhì)和不同化合物的凈化。本研究對(duì)QuChERS方法進(jìn)行了改進(jìn)，加水濕潤(rùn)樣品后使用乙腈提取，以石墨化炭黑（GCB）和C18代替乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取凈化。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米籽粒、鮮玉米及玉米植株中胺唑草酮及其代謝物DA和ISO的殘留分析方法，為胺唑草酮的分析檢測(cè)及相關(guān)市場(chǎng)監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LC-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（日本Shimadzu公司）； EC-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm， 2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）； MX-F渦動(dòng)混合器（中國(guó)Dragonlab公司）； 5415D離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）； GCB（Graphitized carbon black，石墨化炭黑， 40～100 μm ）、C18（40～60 μm）、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，40～60 μm）、0.22 μm有機(jī)濾膜（天津艾杰爾公司）； 乙腈和甲醇為色譜純（美國(guó)Merck公司）； NaCl、無(wú)水MgSO4、甲酸和乙酸銨均為分析純（上?；瘜W(xué)試劑公司）； 水由Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

胺唑草酮、DA和ISO標(biāo)準(zhǔn)品（日本Arysta LifeScience公司）。準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品并用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。玉米樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

2.2 樣品制備

將鮮玉米的籽粒剝下，將玉米植株切成小段，分別用食品加工器粉碎混勻，取約500 g作為待測(cè)樣品；將玉米籽粒用研磨器粉碎并過(guò)20目篩，混勻后取約500 g作為待測(cè)樣品。

2.2.1 鮮玉米及玉米籽粒處理 稱(chēng)取經(jīng)過(guò)勻質(zhì)的鮮玉米或玉米籽粒樣品5.0 g（精確至0.01 g）至25 mL聚丙烯離心管中，依次加入5 mL水、10 mL乙腈、1 g NaCl和3 g無(wú)水MgSO4，渦旋提取3 min。以3000 r/min離心5 min，取1 mL上清液至裝有50 mg GCB、50 mg C18和150 mg無(wú)水MgSO4的2 mL離心管內(nèi)，渦旋1 min。以8000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

2.2.2 玉米植株處理 稱(chēng)取經(jīng)過(guò)勻質(zhì)的玉米植株樣品2.5 g（精確至0.01 g）至 25 mL聚丙烯離心管中，依次加入10 mL水、10 mL乙腈、1 g NaCl和3 g 無(wú)水MgSO4，提取和凈化步驟同2.2.1節(jié)。

2.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)條件

流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min，10% B；1.5～2.0 min，10%～90% B； 2.0～6.0 min， 90% B。 柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。endprint

電噴霧電離源（ESI）正離子模式檢測(cè)；加熱模塊溫度400℃；霧化氣流量1.5 L/min （N2，99.99%）；干燥氣流量15.0 L/min （N2，99.99%）；離子源電壓3.5 kV；去溶劑化（Desolvation line，DL）溫度250 ℃； 碰撞誘導(dǎo)解離（Collision induced dissociation，CID）氣壓230 kPa （Ar，99.999%）。3種化合物的質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了正、負(fù)離子掃描模式對(duì)3種化合物的響應(yīng)。結(jié)果表明，正離子模式下，3種化合物的響應(yīng)值明顯高于負(fù)離子掃描模式。

在流動(dòng)相中添加乙酸銨或甲酸是改善色譜峰形、提高儀器響應(yīng)值和離子化效率的常用有效手段。通常采用酸性流動(dòng)相有利于質(zhì)譜正離子模式檢測(cè)，而甲酸是在正離子模式下最為常用的試劑之一【6，8，12】。以AMZ和DA的濃度為100 μg/L、ISO的濃度為200 μg/L為實(shí)驗(yàn)條件，

圖2 流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰面積的影響（A： 甲醇-水； B： 甲醇-0.5%甲酸； C： 甲醇-5 mmol/L乙酸銨）

Fig.2 Effect of mobile phase on target compounds （A： Methanol-water； B： methanol-water consisted of 0.5% formic acid； C： methanol-water consisted of 5 mmol/L ammonium acetate）首先比較了甲醇-水（A）和甲醇-0.5%甲酸溶液（B）兩種流動(dòng)相對(duì)3種化合物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，3種化合物在甲醇-水流動(dòng)相中比在甲醇-0.5%甲酸流動(dòng)相中獲得了更高的峰面積（圖2）。其次比較了甲醇-水（A）和甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（C）兩種流動(dòng)相對(duì)3種化合物響應(yīng)的影響。ISO在兩種流動(dòng)相條件下峰面積無(wú)明顯變化，但AMZ和DA在甲醇-5 mmol/L乙酸銨流動(dòng)相中，峰面積更大。故最終確定甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液作為分離3種化合物的流動(dòng)相。

3.2 前處理方法優(yōu)化

通過(guò)加水使樣品膨脹濕潤(rùn)是QuEChERS方法萃取低含水量樣本的常用手段，如谷物【10，17】、茶葉【11】、土壤【8】。玉米籽粒和玉米植株含水量較少，為驗(yàn)證樣品提取時(shí)加水的提取效果，分別稱(chēng)取鮮玉米和玉米籽粒5 g、玉米植株2.5 g（玉米植株含較多纖維，密度小，故稱(chēng)取2.5 g），加5 mL水潤(rùn)濕后，使用10 mL乙腈渦旋提取，按2.2和2.3節(jié)所述步驟進(jìn)行樣品凈化和測(cè)定。結(jié)果顯示，鮮玉米和玉米籽粒中，3種化合物的回收率均在89%～109%之間，符合農(nóng)藥殘留分析方法要求。玉米植株中，AMZ、DA和ISO的回收率分別介于89%～105%， 75%～81%和62%～78%之間，DA和ISO的回收率明顯偏低（表2）。為避免由于提取溶劑增加導(dǎo)致方法檢出限提高，考慮通過(guò)增加加水量而不改變提取溶劑乙腈的體積，改善玉米植株中化合物的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)稱(chēng)取2.5 g玉米植株，植株樣品加水10 mL潤(rùn)濕10 mL乙腈渦旋提取時(shí)，DA和ISO的回收率均有明顯改善，3種化合物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為90.9%～111.0%和3.2%～6.3%（表4）。綜上所述，通過(guò)樣品中加水潤(rùn)濕樣本，且根據(jù)不同基質(zhì)調(diào)整合適的加水量，對(duì)3種目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確測(cè)定具有明顯的提高，因此確定采用5 mL水潤(rùn)濕鮮玉米和玉米籽粒樣本后（玉米植株樣本稱(chēng)取2.5 g，加水10 mL），加入10 mL乙腈提取作為提取方法。

3.3 吸附材料的選擇

QuEChERS方法的原理是通過(guò)乙腈萃取，結(jié)合分散固相萃取凈化，實(shí)現(xiàn)樣品中化合物的提取及雜質(zhì)的去除。其中吸附材料是影響分散固相萃取凈化效果和保證方法準(zhǔn)確度和精密度的最主要因素。鑒于C18，GCB和PSA是應(yīng)用最為廣泛的分散固相萃取吸附材料【5，6，8～13】，本實(shí)驗(yàn)考察了這3種吸附材料（用量均為50 mg）對(duì)3種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附情況（標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為100 μg/L）。結(jié)果表明，雖然PSA對(duì)AMZ和DA無(wú)明顯吸附作用（回收率分別為96%和80%），但其對(duì)ISO具有明顯吸附作用（回收率為41%），而C18和GCB對(duì)3種化合物均無(wú)明顯吸附作用（回收率為102%～119%）。為了保證方法的準(zhǔn)確度，最終確定了50 mg GCB、50 mg C18和150 mg無(wú)水MgSO4作為方法的凈化材料。

3.4 線性相關(guān)、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)

配制1～1000 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，以化合物的峰面積（y）對(duì)化合物的濃度（x，μg/L）繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，3種化合物在1～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9929～0.9995）。按3倍信噪比（S/N）計(jì)算玉米籽粒、鮮玉米和植株中AMZ、DA和ISO的檢出限（LOD）為0.1～1.0 μg/kg。

國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）定義基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的其它成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的綜合影響【19】。影響基質(zhì)效應(yīng)的因素主要由分析儀器、樣品基質(zhì)、前處理手段等組成【12】。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液線性曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液線性曲線，計(jì)算和評(píng)價(jià)方法基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)以η表示： η=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，若|η|<10%，說(shuō)明無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)；反之則說(shuō)明具有明顯基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)【13】。由表3可知，η在-65%～-12%之間，3種化合物均具有明顯的基質(zhì)減弱效應(yīng)，說(shuō)明在對(duì)3種化合物定量時(shí)需選用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量消除基質(zhì)效應(yīng)影響。通過(guò)比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和未凈化的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)對(duì)方法的凈化效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，通過(guò)凈化后，3種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)的絕對(duì)值下降了endprint

表3 3種化合物的溶劑線性方程，未凈化和凈化后的基質(zhì)線性方程，相關(guān)系數(shù)，基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)和檢出限

0.8“a”表示基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未經(jīng)過(guò)分散固相萃取凈化的基質(zhì)配制，“b”表示基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線由經(jīng)過(guò)分散固相萃取凈化的基質(zhì)配制。

“a” means the matrix-matched calibration curves without purification by dispersive solid phase extraction， “b” means the matrix-matched calibration curves with purification by d-SPE.

4.7%～22.4%，表明方法確定的前處理凈化方式具有明顯的凈化效果，適用于玉米籽粒、鮮玉米和玉米植株3種基質(zhì)。

3.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)玉米籽粒、鮮玉米和玉米植株樣品中添加一定濃度的AMZ、DA和ISO標(biāo)準(zhǔn)溶液并靜置30 min后，按2.2和2.3節(jié)所述步驟進(jìn)行樣品凈化和測(cè)定，表4為3個(gè)不同添加水平的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。3種化合物的平均回收率為85%～111%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr）為2.3%～9.1%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDR）為3.1%～11.0%，以上結(jié)果均滿足歐盟關(guān)于農(nóng)藥殘留分析方法和我國(guó)關(guān)于農(nóng)藥殘留分析方法的要求【20】。以最小添加水平表示方法的定量限，本方法中胺唑草酮、DA和ISO的定量限為5 μg/kg，遠(yuǎn)均低于EPA關(guān)于玉米中胺唑草酮的限量要求。表4 AMZ，DA和ISO在玉米和玉米植株中的添加回收率（n=10，%），日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr，%）和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDR，%）

3.6 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證本方法的適用性和實(shí)用性，應(yīng)用本方法對(duì)本地市售15份玉米籽粒樣本進(jìn)行監(jiān)測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，樣本中胺唑草酮及其代謝物的含量均低于方法檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，能有效滿足玉米樣本中胺唑草酮的殘留測(cè)定要求，為胺唑草酮的殘留分析及市場(chǎng)監(jiān)測(cè)提供一種可靠的分析方法。

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