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        血必凈注射液對急性膿毒癥患者Th1/2、內(nèi)毒素及免疫因子影響研究

        2015-07-07 15:54:09方勤蔣剛健陳鑫
        中國生化藥物雜志 2015年5期
        關(guān)鍵詞:血清研究

        方勤,蔣剛健,陳鑫

        (1.漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,河南 漯河 462000;2.漯河市醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南 漯河 462000)

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        血必凈注射液對急性膿毒癥患者Th1/2、內(nèi)毒素及免疫因子影響研究

        方勤1,蔣剛健2,陳鑫2

        (1.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,河南 漯河 462000;2.漯河市醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗科,河南 漯河 462000)

        目的 探討血必凈射液對急性膿毒癥患者血清Th1/2、內(nèi)毒素及脾臟特異性免疫功能的影響及其意義。方法 選取2014年9月~2015年1月于漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院確診為膿毒癥的患者110例,根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為2組:對照組55例,行臨床常規(guī)治療;實驗組55例,在與對照組基礎(chǔ)上加用血必凈注射液。比較2組患者的血流動力學(xué)、血清Th1/2、內(nèi)毒素及脾臟特異性免疫功能。結(jié)果 實驗組患者心率低于對照組(P<0.05),平均動脈壓以及中心靜脈壓高于對照組(P<0.05),縮血管藥物應(yīng)用低于對照組(P<0.05),Th1/Th2比值高于對照組(P<0.05),血清內(nèi)毒素水平低于對照組(P<0.05),淋巴細胞增殖、HLA-DR比例高于對照組(P<0.05),caspase-3細胞陽性指數(shù)低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 血必凈注射液能有效改善膿毒癥患者血流動力學(xué)異常,調(diào)節(jié)血清Th1/Th2水平,降低血清內(nèi)毒素水平,提高脾臟特異性免疫功能,對臨床治療膿毒癥具有重要意義。

        血必凈注射液;膿毒癥;內(nèi)毒素;脾臟特異性免疫功能

        膿毒癥(sepsis)是一種由于嚴重感染而導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng),相關(guān)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),全世界每年約有2000例患者被診斷為膿毒癥,由于現(xiàn)在醫(yī)療抗生素等藥物的濫用,其發(fā)生率亦呈每年1.6%的增長趨勢發(fā)展,死亡率約為20%~50%[1]。文獻報道[2],膿毒癥因嚴重感染而導(dǎo)致的患者全身大范圍的炎癥反應(yīng)以及對機體各個器官的損害并不是細菌或其產(chǎn)生的內(nèi)毒素直接導(dǎo)致的結(jié)果,而是由于形成重度感染的細菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素刺激機體產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)并且通過“瀑布樣”的連鎖反應(yīng)而導(dǎo)致的。近年來研究發(fā)現(xiàn)[3],調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)紊亂在治療膿毒癥時能達到較為滿意的療效。血必凈注射液是一種中藥制劑,具有“行氣活血、祛瘀通絡(luò)”的療效,藥理研究發(fā)現(xiàn)[4],血必凈有良好的抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及改善微循環(huán)的作用。臨床亦有將血必凈注射液應(yīng)用于治療慢性阻塞性肺疾病以及細菌性腹膜炎的報道[5],應(yīng)用于治療膿毒癥的文獻卻鮮有報道。本研究通過對大樣本人群進行分析研究,以探討急性膿毒癥患者經(jīng)血必凈注射液治療后其血清Th1/2、內(nèi)毒素及脾臟特異性免疫功能的變化,為急性膿毒癥患者的及時、有效治療提供新的思路和方法。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 病例選擇2014年9月~2015年1月于漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院以急性膿毒癥為診斷而收入院的患者110例,采用隨機數(shù)字表法隨機分為實驗組和對照組。其中實驗組55例,男性28例,女性27例,年齡21~67歲,平均年齡(45.24±7.25)歲;對照組55例,男性31例,女性24例,年齡19~63歲,平均年齡(47.11±6.73)歲?;颊咭话阗Y料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗獲本院倫理協(xié)會批準(zhǔn),并全程跟蹤。

        1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn):參照2003年國際膿毒癥定義聯(lián)席會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)擬定[6]。膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn):已證實存在或疑似的感染,且同時具有以下指標(biāo),①發(fā)燒(溫度>38.3 ℃);②中心體溫<36 ℃;③心率>90次/分;④白細胞增多癥(WBC>12×109/L)或白細胞減少癥(WBC<4×109/L);⑤動脈低氧血癥(PaO2/FIO2<300);⑥肌酐升高>0.5 mg/dL或44.2 μmol/L。

        排除標(biāo)準(zhǔn):①不愿參與本研究或不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者;②患有急性心肌梗死等危重病者;③患有乙肝、艾滋病等具有較重傳染性疾病患者;④合并有嚴重肝、腎功能不全疾病患者;⑤對血必凈注射液過敏的患者;⑥有嚴重出血傾向者;⑦患有精神類疾病不能配合研究者。

        1.3 治療方法 對照組行抗感染、抗菌藥物治療,保持呼吸道通暢、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、正性肌力藥,血管收縮劑[去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)(上海禾豐制藥有限公,國藥準(zhǔn)字H31021176,生產(chǎn)批號:20120920)]等臨床常規(guī)方案治療;實驗組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20040033),60 mL/次靜脈滴注,以0.9%氯化鈉注射液100 mL稀釋,1次/天。2組均共治療10 d。

        1.4 試劑與儀器 肝素(9041-08-1,純度:>99%,北京賽因坦科技有限公司);抗CD3+、CD4+抗體、羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物(美國sigma公司);兔血清(廣州蕊特生物科技有限公司);PBS緩沖液(上海遠慕生物科技有限公司);DAB-H2O2(武漢博士德生物工程有限公司,武漢);Mayer蘇木素復(fù)染(北京索萊寶科技有限公司)。

        DynaMagTM磁力架(美國life technologies);guava easyCyte 8流式細胞儀(武漢科力瓦貿(mào)易有限公司);RPMI 1640淋巴細胞無血清培養(yǎng)基(規(guī)格:500mL天津灝洋)。

        1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

        1.5.1 實驗組和對照組患者皆留置上腔中心靜脈導(dǎo)管(頸內(nèi)靜脈)。分別于治療前及治療10 d后的同一時刻記錄心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)以及中心靜脈壓(central venous pressure,CVP)。

        1.5.2 Th1/2檢測:所有研究對象均空腹8 h后從肘靜脈抽取靜脈血8 mL。4 mL置于真空采血管中,于室溫下用水平離心機以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,分離血清行基質(zhì)檢測法檢測血清中內(nèi)毒素濃度水平;另4 mL加入肝素抗凝,采用淋巴細胞分離液法分離后得單個核細胞,并在37 ℃環(huán)境下無菌培養(yǎng)0.5 h后,得淋巴細胞懸液;用去離子水溶解淋巴細胞懸液后,行T細胞分離富聚柱法獲得純度較高的的T細胞,各取100 μL加入2試管中,分別加入抗CD3+、CD4+抗體30 μL,混勻后在4 ℃環(huán)境下靜置30 min,加入緩沖液行上流式細胞儀檢測法檢測,結(jié)果以CD3+、CD4+、CD3O-T細胞反映Th1細胞濃度,以CD3+、CD4+、CD3O+T細胞反映Th2細胞濃度。

        1.5.3 脾臟特異性免疫功能檢測方法:2組患者在治療前后行脾臟穿刺獲取脾臟組織,行流式細胞儀檢測法檢測脾淋巴細胞表面白細胞DR抗原(HLA-DR),具體步驟如下:制備活性高的細胞懸液→用10%FCS RPMI1640調(diào)整細胞濃度5×106~1×107/mL→取40 μL細胞懸液加入預(yù)先有特異性單克隆抗體(5~50 μL)(蘇州杰思生物技術(shù)有限公司)的小玻璃管或塑料離心管,再加50 μL 1:20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清→4 ℃ 30 min用洗滌液洗滌2次,每次加洗滌液2 mL左右1000 r/min×5 min→棄上清,加入50 μL工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物,充分振搖→4 ℃ 30 min用洗滌液洗滌2次,每次加液2mL左右1000 r/min×5 min→加適量固定液→流式細胞儀檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察。

        1.5.4 脾淋巴細胞caspase-3的陽性指數(shù)檢測:行免疫組化方法檢測脾淋巴細胞caspase-3的陽性指數(shù),具體步驟如下:采集的標(biāo)本按常規(guī)脫蠟,采用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液沖洗1次,枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)后,PBS沖洗1次。按照試劑盒(美國Sigma公司)說明進行非生物素二步法檢測,DAB-H2O2顯色,Mayer蘇木素復(fù)染,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分別檢測免疫組化的陽性面積,計算caspase-3陽性指數(shù)=陽性面積×平均A值。

        2 結(jié)果

        2.1 患者的一般資料 本研究共收集患者110例,男性59例,年齡46(21~62)歲;女性51例,年齡49(19~63)歲。在各項人口學(xué)基本特征數(shù)據(jù)中,2組患者的性別、年齡、病程、體溫、呼吸、心率、血肌酐、白細胞的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

        2.2 治療后2組患者血流動力學(xué)情況比較 經(jīng)治療,實驗組患者心率明顯低于對照組,平均動脈壓以及中心靜脈壓高于對照組,縮血管藥物應(yīng)用低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        表2 2組患者血流動力學(xué)比較±s)Tab.2 Comparison of ±s)

        *P<0.05,與同組治療前比較,compared with the same group before treatment;#P<0.05,與對照組治療后比較,compared with control group after treatment

        2.3 2組患者治療前后Th1/Th2情況比較情況 本研究中,治療前2組患者Th1、Th2、Th1/Th2計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)10 d治療后,實驗組患者Th1計數(shù)明顯高于對照組(P<0.05),Th2計數(shù)明顯低于對照組(P<0.05),Th1/Th2比值明顯高于對照組(P<0.05),見表3。

        表3 2組患者Th1/Th2變化比較Tab.3 Comparison of Th1/Th2 between two ±s,%)

        *P<0.05,與同組治療前比較,compared with the same group before treatment;#P<0.05,與對照組治療后比較,compared with control group after treatment

        2.4 治療10 d后2組患者血清內(nèi)毒素濃度水平比較 本研究中,經(jīng)治療10 d后,2組患者血清內(nèi)毒素水平均較治療前有所降低(P<0.05),但實驗組患者血清內(nèi)毒素水平明顯低于對照組(P<0.05),見表4。

        2.5 2組患者治療前后脾臟特異性免疫功能情況比較 本研究中,經(jīng)10d治療后,實驗組患者淋巴細胞增殖、HLA-DR比例明顯高于對照組(P<0.05),caspase-3細胞陽性指數(shù)明顯低于對照組(P<0.05),見表5。

        表4 2組患者血清內(nèi)毒素濃度水平變化比較±s)Tab.4 Comparison of endotoxin concentration between two ±s)

        *P<0.05,與同組治療前比較,compared with the same group before treatment;#P<0.05,與對照組治療后比較,compared with control group after treatment

        表5 2組患者脾臟特異性免疫功能變化比較±s)Tab.5 Comparison of specific immune-system between two ±s)

        *P<0.05,與同組治療前比較,compared with the same group before treatment;#P<0.05,與對照組治療后比較,compared with control group after treatment

        3 討論

        膿毒癥是嚴重威脅人類生命健康的危重疾病之一,以其高發(fā)病率和高死亡率而備受醫(yī)療工作者的重視。膿毒癥的發(fā)病多與感染因素有關(guān),最近高齡化(>65歲)、糖尿病、癌癥也被證實與膿毒癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系,而近年來年齡結(jié)構(gòu)的高齡化、糖尿病、癌癥的發(fā)病率的升高,可能也是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)病率增高的潛在因素[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8],膿毒癥患者多會伴有血流動力學(xué)異常、免疫系統(tǒng)失調(diào)以及脾臟特異性免疫功能異常等病理變化,因此治療除抗感染外也多偏向于抗休克、調(diào)節(jié)免疫等。血必凈注射液是一種新的中藥制劑,方中紅花為君以活血化瘀,赤芍、川芎為臣以助君藥行血活血,丹參、當(dāng)歸共為佐使以養(yǎng)血活血,全方共奏“涼血活血、祛瘀通絡(luò)、行氣止痛”之功,正符合了王今達教授所提治膿毒癥“菌毒并治”的理論[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10],血必凈注射液具有良好的抗凝血、保護內(nèi)皮細胞抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫平衡以及改善微循環(huán)的作用,臨床應(yīng)用亦取得了較好的療效。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血流動力學(xué)具有較為明顯的異常,而血必凈注射液可有效糾正膿毒癥患者血流動力學(xué)的異常。從表2中可以看出,治療后實驗組患者心率明顯低于對照組,而MAP、CVP較治療前明顯升高,且優(yōu)于對照組。研究發(fā)現(xiàn)[11],膿毒癥患者血管內(nèi)皮細胞會釋放大量一氧化氮,從而誘導(dǎo)血管擴張導(dǎo)致彌漫性血管擴張型低血壓的發(fā)生,嚴重則會導(dǎo)致休克。而本研究實驗結(jié)果顯示,實驗組患者在應(yīng)用血必凈注射液后其心率明顯降至正常水平,說明感染已經(jīng)得到一定的控制,MAP、CVP也已回升至正常水平,可見血必凈注射液能夠有效改善膿毒癥患者低血壓的情況,且縮血管藥物應(yīng)用降低更進一步證明了其治療膿毒癥低血壓的有效作用。

        結(jié)果發(fā)現(xiàn),血必凈注射液能有效提高膿毒癥患者Th1水平、降低Th2水平以及改善兩者之間的比例。膿毒癥患者因感染而導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)失調(diào),而Th1、Th2水平的平衡是保持免疫系統(tǒng)正常的主要因素[12]。Th1細胞主要以產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、IFN-β等炎性因子為主,以參與細胞免疫、參與細胞和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答發(fā)揮其作用;Th2細胞主要以產(chǎn)生IL-5、IL-10等為主,以參與體液免疫、刺激B細胞產(chǎn)生抗體發(fā)揮其免疫作用。研究證實[13],Th1細胞產(chǎn)生的細胞因子能抑制Th2細胞的增殖分化,卻能促進自身分化成熟;Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子亦能抑制Th1細胞的增殖分化,促進自身分化成熟。由此可見,Th1、Th2細胞具有相互抑制的作用,而膿毒癥的治療,必須保證Th1/Th2的平衡。研究發(fā)現(xiàn)[14],重癥膿毒癥患者Th1水平降低,Th2水平卻顯著升高,Th1/Th2水平降低,此現(xiàn)象直接增高患者死亡率,而有效降低Th2細胞的水平則會增加患者生存率。以上研究結(jié)果從側(cè)面證實了血必凈注射液可有效調(diào)節(jié)Th1/Th2水平,增加膿毒癥患者的生存率。

        實驗得出,血必凈注射液具有降低膿毒癥患者血清內(nèi)毒素水平、調(diào)節(jié)脾臟特異性免疫功能的作用。內(nèi)毒素(endotoxin)存在于革蘭陰性菌細胞壁外膜上的一種脂多糖成分,主要在細菌死亡、裂解時釋放,但是卻可以通過刺激機體產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)發(fā)生“瀑布樣”連鎖反應(yīng)而導(dǎo)致患者大范圍的炎癥反應(yīng)以及器官功能的損害,因此有效降低膿毒癥患者血清內(nèi)毒素水平是控制、治療本病的重點方向。有研究發(fā)現(xiàn)[15],血必凈注射液具有直接抗內(nèi)毒素的作用,在表4中可以看出血必凈注射液能有效降低患者血清內(nèi)毒素水平,與前者的結(jié)論一致。亦有文獻研究指出[16-17],膿毒癥晚期患者體內(nèi)脾臟淋巴細胞大量凋亡,而血必凈注射液不僅能降低血清內(nèi)毒素水平,還能有效減少淋巴細胞的凋亡,增加淋巴細胞的增殖,提高免疫水平,這一結(jié)論在本研究中也得到了證實,表5顯示淋巴細胞增殖明顯優(yōu)于治療前和對照組。HLA-DR是加工處理抗原微生物的重要分子,還具有抑制免疫細胞間相互作用從而控制免疫應(yīng)答強度的作用,因此有研究指出要通過調(diào)節(jié)HLA-DR的表達水平而達到調(diào)節(jié)免疫平衡的目的[18]。在本研究中,血必凈注射液有效提高了HLA-DR的表達水平,這一結(jié)果也可能是血必凈能有效調(diào)整膿毒癥患者免疫炎癥反應(yīng)的原因。Caspase-3是天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶,具有激活某些特殊的信號系統(tǒng)而達到DNA凋亡的作用,其水平的高低決定凋亡的嚴重程度[19]。本研究結(jié)果顯示,血必凈注射液能有效降低Caspase-3細胞陽性率,從而證明其能夠降低淋巴細胞的凋亡,保證機體正常的免疫調(diào)節(jié)。

        本研究證實了血必凈對膿毒癥患者具有更好的療效。因此,對于急性膿毒癥患者及時應(yīng)用血必凈注射液進行治療具有重要意義。在今后研究中,本課題組將對血必凈影響膿毒癥患者血清內(nèi)毒素、Th1/Th2水平的實質(zhì)原因進行深入研究,為本實驗所得出的結(jié)果做出進一步論證和分析。

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        (編校:王儼儼)

        Study on effect of Xuebijing injection on Th1/2, endotoxin and immune factors in patients with acute sepsis

        FANG Qin1, JIANG Gang-jian2, CHEN Xin2

        (1.Department of Intensive Care Unit, The First Affiliated Hospital of Luohe Med & Cal College, Luohe 462000, China; 2.Department of Inspection, The First Affiliated Hospital of Luohe Med & Cal College, Luohe 462000, China)

        ObjectiveTo investigate effect of Xuebijing injection on Th1/2, endotoxin and immune factors in patients with acute sepsis.Methods110 cases of sepsis patients were selected and divided into two groups from September 2014 to January 2015.The control group of 55 cases were treated by clinical routine therapy, the experiment group of 55 cases were treated with Xuebijing injection on the basis of control group.Hemodynamics, serum Th1/2, endotoxin and specific immunological function of spleen were compared.ResultsAfter treatment, the heart rate of experiment group was significantly lower than control group (P<0.05), the mean arterial pressure and central venous pressure were higher than control group (P<0.05), vasoconstrictive drugs application amount was less than control group (P<0.05), the ratio of Th1/Th2 was higher than control group (P<0.05), serum endotoxin levels was lower than control group (P<0.05), and the ratio of HLA-DR, lymphocyte proliferation and positive index of caspase-3 cells were lower than control group(P<0.05).ConclusionXuebijing injection can effectively improve haemodynamics in patients with sepsis, regulate serum Th1/Th2 levels, reduce serum endotoxin level and enhance specific immune function of spleen, which has important significance for clinical treatment of sepsis.

        Xuebijing injection; sepsis; endotoxin; specific immune function of spleen

        方勤,女,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:重癥醫(yī)學(xué),E-mail:fangqinys@126.com。

        R278

        A

        1005-1678(2015)05-0130-04

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