黃麗菊，張桂芳

(1.海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院 感染科，海南 三亞 572000；2.河北省遵化市人民醫(yī)院，河北 遵化 064200)

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替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌adeB基因表達水平的影響

黃麗菊1，張桂芳2

(1.海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院 感染科，海南 三亞 572000；2.河北省遵化市人民醫(yī)院，河北 遵化 064200)

目的 探討替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌adeB基因表達水平的影響。方法 收集2012年9月至2014年9月在海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院分離的57株多重耐藥鮑曼不動桿菌，采用E- test(Epsilome test)法測定替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，采用PCR擴增技術(shù)檢測adeB、adeR、adeS外排泵基因分布情況，采用實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測各基因相對表達水平。結(jié)果 57株多重耐藥鮑曼不動桿菌MIC值為0.1～8 μg/mL，計算MIC50=2 μg/mL，MIC90=4 μg/mL；其中敏感49株占86.0%，中介5株占8.8%，耐藥3株5.2%。將57株細菌按照MIC的范圍分為敏感性降低組38株和敏感組19株，敏感性降低組對替加環(huán)素敏感菌株30株占78.9%，敏感組對替加環(huán)素敏感菌株19株占100.0%，敏感組對替加環(huán)素敏感性顯著高于敏感性降低組(P<0.05)。所有菌株中，共有41株同時檢測出adeB、adeR、adeS基因，占86.0%；敏感性降低組檢測出adeB、adeR、adeS基因29株占70.7%，敏感組12株占63.2%，2組比較差異無統(tǒng)計學意義；熒光RT-PCR檢測結(jié)果顯示，敏感性降低組adeB基因相對表達量顯著低于敏感組(P<0.05)，兩組adeR、adeS基因相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 AdeB基因在降低多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性方面發(fā)揮著重要的作用，但是可能還存在adeB以外基因參與調(diào)控對替加環(huán)素的耐藥。

替加環(huán)素；鮑曼不動桿菌；最低抑菌濃度；基因表達

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染的常見條件致病菌，調(diào)查顯示[1]其位居非發(fā)酵菌感染的第二位，僅次于銅綠假單胞菌。隨著大量廣譜抗菌藥及免疫抑制劑的廣泛使用，多重耐藥鮑曼不動桿菌已在全世界范圍內(nèi)廣泛分布。既往多采用耐碳青霉烯類抗菌藥治療多重耐藥鮑曼不動桿菌，并取得了一定療效，但是由于泛耐藥株的出現(xiàn)，給臨床治療和預防帶來的極大挑戰(zhàn)。目前新型甘氨酰環(huán)類抗菌藥替加環(huán)素的問世，其治療多重耐藥鮑曼不動桿菌的廣闊前景已經(jīng)被廣大臨床工作者重視，并被認為是控制多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的最后一道屏障。由于耐藥因素與環(huán)境、人種、遺傳條件等因素密切相關(guān)，導致多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性差異較大。本研究對本院分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素耐藥機制進行初步探討，以期為臨床合理用藥、感染控制提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究成果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2012年9月～2014年9月在本院分離的57株多重耐藥鮑曼不動桿菌，所有細菌均經(jīng)鑒定證實，且對目前常用藥物(β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類)均耐藥。質(zhì)控菌銅綠假單胞菌(ATCC27853)和大腸埃希菌(ATCC25922)均購至中國生物制品檢驗所。

1.2 儀器與試劑 PCR儀由美國ABI公司提供，Real-time PCR儀及核酸電泳儀均購至美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)由英國UVI tec公司提供。替加環(huán)素(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，50mg/支)，引物由Invitrogen公司合成。

1.3 方法

1.3.1 體外敏感性:采用E-test(Epsilome test)法測定替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，操作及讀數(shù)均參考試劑條說明書，藥物敏感性解釋標準參考美國臨床實驗室標準化委員會[2](national committee for clinical laboratory standards,NCCLS)推薦標準，其中MIC≤2 μg/mL為敏感，4 μg/mL中介，8 μg/mL為耐藥；根據(jù)MIC的范圍計算出MIC50和MIC90。

1.3.2 檢測外排泵基因分布：根據(jù)基因組試劑盒說明書對各菌株的基因組進行提取，引物序列按照多重耐藥鮑曼不動桿菌adeB、adeR、adeS外排泵基因保守序列進行合成，反應體系：5×Prime Script Buffer 4 μL、1×Master Mix 1 μL、Random 6mers 1 μL、總RNA 4 μL、ddH2O 10 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s，循環(huán)45次，延伸72 ℃ 5 min；PCR產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳，紫外下觀察，將符合要求的目的片段進行測序。

1.3.3 adeB基因表達水平檢測：菌株總RNA提取后，以看家基因rpoB為內(nèi)參基因合成引物(見表1)，采用實時熒光RT-PCR進行逆轉(zhuǎn)錄：94 ℃ 30 s，75 ℃ 1 min，循環(huán)45次。按照配套軟件計算各樣本rpoB、adeB基因CT值，adeB基因相對表達量按照adeB2-△△CT計算。

表1 rpoB、adeB基因引物序列Tab.1 rpoB and adeB gene primer sequences

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件包進行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，F(xiàn)isher精確概率法，2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外敏感性檢測結(jié)果 57株多重耐藥鮑曼不動桿菌MIC值為0.1～8 μg/mL，計算MIC50=2 μg/mL，MIC90=4 μg/mL；其中敏感49株占86.0%，中介5株占8.8%，耐藥3株5.2%。按照MIC的范圍，將57株細菌分為敏感性降低組(MIC≥2 μg/mL)38株和敏感組(MIC≤1 μg/mL)19株，其中敏感性降低組對替加環(huán)素敏感菌株30株占78.9%，敏感組對替加環(huán)素敏感菌株19株占100.0%，敏感組對替加環(huán)素敏感性顯著高于敏感性降低組(χ2=4.653,P=0.031)。

2.2 外排泵基因分布 所有菌株中，共有41株(71.9%)檢測出adeB(981bp)、adeR(449bp)、adeS(543bp)基因，另外7株檢測出adeB和adeR基因，5株檢測出adeB和adeS基因，4株檢測出adeR和adeS基因；其中敏感性降低組檢測出adeB、adeR、adeS基因28株占73.7%，敏感組13株占68.4%，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.174,P=0.677)。

2.3 adeB基因表達水平分析 熒光RT-PCR檢測結(jié)果顯示，敏感性降低組adeB基因相對表達量顯著低于敏感組(P<0.05)，2組adeR、adeS基因相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各基因表達水平比較Tab.2 Comparison of gene expression levels

3 討論

鮑曼不動桿菌科廣泛定植于醫(yī)院內(nèi)各種干燥或潮濕物體表面(如窗簾、門把手、機械通氣設備等)和人體皮膚，往往是造成該菌在醫(yī)院內(nèi)傳播的重要原因。鮑曼不動桿菌通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子等可移動基因元件，獲得對多種抗菌藥物的耐藥性。多重耐藥鮑曼不動桿菌是指對5類抗菌藥中的3類及以上藥物耐藥，為多重耐藥菌株，包括頭孢菌素、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類。若對以上抗菌藥物均耐藥，則稱之為泛耐藥鮑曼不動桿菌。隨著多重耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)，給臨床上治療帶來極大挑戰(zhàn)。替加環(huán)素被認為是預防其感染的最后一道防線；然而目前國內(nèi)關(guān)于多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性的報道較少，國外有研究稱[3]大量抗菌藥物使用所帶來的選擇壓力導致多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性有降低趨勢。由于既往多采用碳青霉烯類抗生素治療鮑曼不動桿菌，其極有可能誘導鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥[4]，提示碳青霉烯類的濫用可能是導致多重耐藥鮑曼不動桿菌出現(xiàn)的一個潛在誘因。本研究對本院分離的鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性進行檢測，結(jié)果顯示MIC范圍為0.1～8 μg/mL，MIC50為2 μg/mL，MIC90為4 μg/mL。佘婷婷[5]報道稱其檢測多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性為96.4%，MIC90為2 μg/mL；而國外報道稱[6]歐洲鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性僅為59.3%，說明不同地區(qū)菌株的敏感性差異較大，說明抗生素選擇壓力與區(qū)域、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)。

目前已經(jīng)證實[7-9]，外排泵高表達是導致鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性降低的原因之一；本研究中，57株病原菌共有41株同時檢測出adeB、adeR和adeS外排泵基因，占71.9%；而敏感性降低組與敏感組3種外排泵基因檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義。馬真[10]證實ade ABC基因僅表達于多重耐藥鮑曼不動桿菌，而在對替加環(huán)素敏感的菌株中為陰性。推測可能原因是外排泵基因是鮑曼不動桿菌的固有基因，當細菌與外排泵系統(tǒng)的底物接觸時，會促進外排泵呈現(xiàn)高表達，進而導致菌株發(fā)生耐藥[11-13]。進一步采用熒光RT-PCR檢測adeB基因相對表達水平，結(jié)果顯示敏感性降低組adeB基因相對表達量顯著低于敏感組，提示adeB高表達是鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素耐藥的發(fā)生機制之一。然而在研究中同時發(fā)現(xiàn)2組adeR、adeS基因相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義，這最少提示adeR、adeS基因相對表達水平可能與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥無直接聯(lián)系。周云[14]報道稱adeB基因表達水平與對替加環(huán)素MIC值大小存在正相關(guān)。在本研究中，雖然敏感組adeB基因顯著低于敏感性降低組，但是仍未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性，推測除adeB基因外，可能尚存在其他機制參與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥。王悅[15]報道稱多重耐藥鮑曼不動桿菌除了發(fā)現(xiàn)adeABC外排系統(tǒng)外，還發(fā)現(xiàn)有adeIJK、adeDE等外排系統(tǒng)，但是目前對這些機制依然不明，很多具體作用機制仍需要更深入研究。

綜上所述，adeB基因在降低多重耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性方面發(fā)揮著重要的作用，adeR、adeS基因相對表達水平與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥無直接聯(lián)系；因此可能還存在adeB以外基因參與調(diào)控對替加環(huán)素的耐藥。

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(編校：譚玲)

Effect of tigecycline on expression of adeB gene of multidrug resistanceAcinetobacterbaumannii

HUANG Li-ju1, ZHANG Gui-fang2

(1.Department of Infection, Sanya Nongken Hospital of Hainan, Sanya 572000, China; 2. Zunhua People’s Hospital, Zunhua 064200, China)

ObjectiveTo explore the adeB gene expression level impact of tigecycline for multidrug resistanceAcinetobacterbaumannii.Methods57 strains multidrug resistanceAcinetobacterbaumanniiwere separated from September.2012 to September.2014. Epsilome test method was used to detect minimum inhibitory concentration of tigecycline against multi drug resistantAcinetobacterbaumannii. PCR amplification detected adeB, adeR, adeS efflux pump gene distribution. Real-time fluorescent RT-PCR detection technology were used to detect relative expression level of each gene.Results57 strains of multidrug-resistant Acinetobacter Bauman MIC value were 0.1-8 μg/mL. The calculation of MIC50=2 μg/mL, MIC90=4 μg/mL. 49 strains sensitivity accounted for 86.0%, 5 intermediate strains accounted for 8.8%, 3 resistant strains accounted for 5.2%. 57 strains of bacteria were divided into 38 strains lower sensitivity group and 19 strains sensitive group, with reduced susceptibility in lower sensitivity group 30 strains, accounting for 78.9%, sensitive group were all sensitive to tigecycline, accounting for 100%, for tigecycline susceptibility sensitive group was significantly higher than that of lower sensitivity group(P<0.65). 41 strains were detected adeB, adeR, adeS gene in all strains, accounted for 86.0%, 29 strains were detected adeB, adeR, adeS genes in lower sensitivity group, accounted for 70.7%,12 strains were detected in sensitive group accounted for 63.2%, the difference between the two groups had no statistical significance.Fluorescent RT-PCR detection results showed that the relative expression of adeB gene with lower susceptibility group was significantly lower than that of sensitive group (P<0.05), relative expression levels of adeR and adeS gene in two groups had no significant difference.ConclusionAdeB gene plays an important role in tigecycline for multidrug resistanceAcinetobacterbaumannii, but may also exist outside of the adeB gene is involved in the regulation of resistance to tigecycline.

tigecycline;Acinetobacterbaumannii; minimal inhibitory concentration; gene expression

黃麗菊，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：醫(yī)院感染管理和傳染性疾病控制，E-mail：grkhlj@126.com。

R38

A

1005-1678(2015)05-0047-03