王珂佳，劉蕓，任艷玲Δ

(1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

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富硒化對博落回有效成分抑菌效果的影響研究

王珂佳1，劉蕓2，任艷玲1Δ

(1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

目的 研究富硒化對博落回姚效成分抑菌效果的影響。方法 以青霉素鈉、生理鹽水為對照，采用瓊脂擴(kuò)散紙片法檢測各富硒化博落回組處理9種常見細(xì)菌的平均抑菌圈直徑；以20%甲醇、生理鹽水作為對照，用20%的甲醇將平均抑菌圈最小的富硒化博落回組，無硒處理博落回組和青霉素鈉組分別稀釋，使?jié)舛染鶠?.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL，采用瓊脂平板稀釋法測定其MIC，評價對其9種常見細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果 富硒化處理能大幅提高博落回生物堿的抑菌效果，100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈最小(15.33 mm)；富硒化博落回生物堿對大腸桿菌O1、大腸桿菌P22、都伯林大腸桿菌的最低抑菌濃度為從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；對鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌的最低抑菌濃度為0.12 mg/mL；對金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL；對枯草芽孢桿菌和李氏桿菌的最低抑菌濃度小于0.03 mg/mL。結(jié)論 富硒化顯著改善博落回的抑菌效果，為今后富硒博落回的開發(fā)利用，奠定了理論基礎(chǔ)。

富硒化；博落回；血根堿；抑菌效果

博落回MacleayaCordata(wild) R.Br.為罌粟科博落回屬多年生草本植物，別名三錢三，又名筒桿、滾地龍等，在貴州又稱馬耳桿，黃薄荷[1]。博落回中主要含有血根堿(sanguinarine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)、黃連堿(coptisine)、小檗堿(berberine)、博落回堿(boccon-line)、α-別隱品堿(α-allocryptopine)、β-別隱品堿(β-allocryptopine)等異喹啉衍生物類生物堿[2]，其在抗菌消炎、清熱解毒、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等方面具有顯著作用[3]。趙東亮等[4]研究證明鹽酸血根堿具有很強(qiáng)的廣譜抑菌作用。王朝元等[5]研究發(fā)現(xiàn)博落回總生物堿抗菌作用較強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的抑制作用尤為顯著。此外，楊軍等[6]藥理研究表明，博落回對四氯化碳所致慢性肝損傷有顯著療效。硒元素為人體必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)的重要成分，硒元素在消除體內(nèi)多種有害自由基,增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗細(xì)胞衰老，抗氧化，抗癌等方面都有突出的作用，硒缺乏會導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病等地方性疾病[7-8]。目前，隨著對硒元素生理作用研究的不斷深入，證明了硒元素與人體健康關(guān)系密切。我國傳統(tǒng)的中草藥，在補(bǔ)硒方面具有明顯的優(yōu)勢。經(jīng)過富硒處理的中草藥，治病同時可以補(bǔ)硒，且無機(jī)硒經(jīng)中藥植株吸收轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒后，可以降低毒性，提高血硒含量[9]。本文選擇抗菌效果作為考察指標(biāo)[4-5]，比較富硒化博落回提取液和無硒處理博落回提取液對9種常見細(xì)菌的抑制效果，研究富硒化對博落回有效成分抑菌效果的影響，為富硒博落回的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 供試菌種共9種，由貴州大學(xué)藥理實驗室提供。分別為大腸桿菌P22(EscherichiacoliP22，E.coliP22)，豬霍亂桿菌(Baclilluscholeraesuis,B.choleraesuis)，豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)，大腸桿菌O1(EscherichiacoliO1，E.coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)，李氏桿菌(Listeriamurrayi，L.murrayi)，鼠傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)，都伯林大腸桿菌(EscherichiaDublin，E.Dublin)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)。

1.2 藥品與試劑 博落回采自產(chǎn)地貴州省施秉縣，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅應(yīng)春副教授鑒定為罌粟科植物博落回MadeayaCordate(Wild)R.Br。牛肉膏(購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；蛋白胨(購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；瓊脂粉(購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；注射用青霉素鈉(800萬單位，購自華北制藥有限公司)。氯化鈉(購自天津市大茂試劑廠)；鹽酸，氫氧化鈉(購自重慶川江試劑廠)；亞硒酸鈉(購自成都市科龍試劑廠)。

1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：用于細(xì)菌培養(yǎng)。主要成分蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉8 g，蒸餾水1000 mL， pH 7.0～7.5。

1.4 方法

1.4.1 博落回富硒化處理：采用分根繁殖手段移栽15株博落回植株，設(shè)置0、60、80、100、120 μg/mL Na2SeO35個實驗組[10-11]，每組均含3株博落回植株。待幼苗成活并長至20 cm時，分別用對應(yīng)濃度的亞硒酸鈉溶液進(jìn)行葉面噴施，每月1次，共3次。待博落回果實成熟后，采樣曬干，粉碎成細(xì)粉過60目篩備用。

1.4.2 藥物制備：按王珂佳等[12]方法提取富硒化處理各組博落回生物堿，提取液用20 %甲醇定容，使提取液中血根堿濃度為0.5 g/mL。冷藏備用。

1.4.3 藥品配制：將經(jīng)富硒化博落回生物堿提取液(血根堿濃度0.5 g/mL)，用20%甲醇配制成血根堿含量分別為0.96 mg/mL和4.8 mg/mL的溶液，備用。

1.4.4 菌懸液的制備：用接種環(huán)在斜面上先劃一條直線，再蘸取已活化菌種在斜面上劃Z字性斜線，避免菌種間污染，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，觀察培養(yǎng)情況并選取生長情況良好的菌種，用含0.1 %吐溫80生理鹽水將菌種洗出，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，用血球計數(shù)板調(diào)整菌液濃度至105～106個/mL。

1.4.5 抑菌試驗：① 定性試驗：采用瓊脂擴(kuò)散紙片法[4]進(jìn)行富硒化博落回生物堿抑菌效果定性試驗。用含0.1 %吐溫80生理鹽水將菌種洗出，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，用移液槍(槍頭需經(jīng)高壓滅菌)吸取50 μL菌液放入盛有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布棒均勻涂抹，倒置10 min。再用移液槍分別吸取血根堿含量為0.96 mg/mL的各富硒化處理組藥品10 μL，添加到直徑為7 mm濾紙片(已高壓滅菌)上，把濾紙片放入培養(yǎng)皿中，以青霉素鈉、生理鹽水為對照，每個培養(yǎng)皿放同種藥品各個待測物濾紙片各1片，重復(fù)3次，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，觀察測量，取平均值。

② 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測定：采用瓊脂平板稀釋法[4]測定富硒化博落回生物堿的MIC。用20 %的甲醇將定性試驗中平均抑菌圈最小的一組富硒化博落回生物堿提取液，無硒處理博落回生物堿和青霉素鈉分別稀釋，富硒化博落回生物堿、無硒處理博落回生物堿的濃度分別為0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL；青霉素鈉濃度分別為0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL。以20 %甲醇、生理鹽水作為對照。將所培養(yǎng)的9種菌種稀釋至1×105個/mL, 用多點接種器蘸取制備好菌液(約1～2 μL)接種于上述制備的平板培養(yǎng)基表面，每點菌數(shù)約100～200個，形成直徑為8～10 mm的菌斑，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)操作3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 富硒化博落回生物堿對不同菌種的抑菌效果 經(jīng)富硒化處理博落回生物堿比對照組的抑菌效果有大幅度提高，且博落回生物堿抑菌效果，隨植株中硒元素含量增加而提高。100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最小。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 富硒化博落回生物堿的抑菌效果實物圖1.0 μg/mL亞硒酸鈉處理組；2.60 μg/mL亞硒酸鈉處理組；3.80 μg/mL亞硒酸鈉處理組；4.100 μg/mL亞硒酸鈉處理組；5.120 μg/mL亞硒酸鈉處理組；6.青霉素鈉；7.生理鹽水Fig.1 Inhibitory effect of se-Madeaya Cordate(Wild)R.Br alkaloids physical map1.0 μg/mL sodium selenite treatment group;2.60 μg/mL sodium selenite treatment group; 3.80 μg/mL sodium selenite treatment group;4.100 μg/mL sodium selenite treatment group; 5.120 μg/mL sodium selenite treatment group;6.penicillin sodium;7.saline

組別實驗菌種E.coliP22B.choleraesuisS.suisE.coliO1S.aureusL.murrayiS.typhimuriumE.DublinB.subtilis平均值青霉素鈉組0272940273.67生理鹽水組0120111000.67亞硒酸鈉處理組0μg/mL71211717151251511.2260μg/mL13171212192017122115.8880μg/mL14191312201819142316.89100μg/mL12171310181718122115.33120μg/mL16181311212018112116.56

0 μg/mL的亞硒酸處理組為空白對照，青霉素鈉為陽性對照，生理鹽水為陰性對照

2.2 富硒化博落回生物堿的最低抑菌濃度 在2.1項下的各實驗組中，與其他處理組相比，100 μg/mL亞硒酸鈉處理組的平均抑菌圈最小，故選取該組測定富硒化博落回生物堿最低抑菌濃度，見表2。

表2 富硒化博落回生物堿對種細(xì)菌的最低抑菌濃度,n=3)

CK1：生理鹽水對照；CK2：20 %甲醇對照?！啊睘闊o菌生長，“+”為少量菌生長，“+++”為大量菌生長

由表2可知，經(jīng)富硒化處理博落回生物堿對以上細(xì)菌的最低抑菌濃度都有一定降低。其中，對E.coliO1、E.coliP22、E.Dublin的最低抑菌濃度為從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL； 對S.typhimurium、B.choleraesuis的最低抑菌濃度為0.12 mg/mL；對S.aureus、S.suis的最低抑菌濃度為0.06 mg/mL；對B.subtilis和L.murrayi的最低抑菌濃度小于0.03 mg/mL，效果較好。

3 討論

研究證明，作為中藥材資源豐富的貴州省，其土壤全硒含量范圍為0.064～1.326 mg/kg，平均值為0.369 mg/kg，高于世界(0.200 mg/kg)和全國(0.290 mg/kg)土壤平均硒含量[13]。貴州省內(nèi)土壤局部達(dá)到富硒水平，適宜發(fā)展富硒中藥材產(chǎn)業(yè)。同時，中藥博落回在貴州有廣泛分布，其生物堿具有一定的抑菌作用，除大腸桿菌以外，對于其他桿菌、球菌，革蘭氏陰性和陽性菌均有極強(qiáng)的抑菌效果[1-2]。為了進(jìn)一步改善博落回總生物堿的抗菌效果，提高其抗菌譜，本研究以硒元素作為添加劑，研究了富硒化處理博落回的抑菌效果。研究結(jié)果表明：與青霉素鈉比對，富硒化處理的博落回生物堿對大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌等9種細(xì)菌的抑菌效果得到顯著增強(qiáng)，且其抑菌效果在一定范圍內(nèi)與亞硒酸鈉濃度成正相關(guān)，亞硒酸鈉濃度為100 mg/mL時其平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最?。桓晃┞浠厣飰A的最低抑菌濃度均都有大幅的降低，尤其是大腸桿菌的最低抑菌濃度，從原來0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；降幅顯著。綜上所述，富硒化有利于改善博落回的抑菌效果，為今后富硒博落回的開發(fā)利用，奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] 張秀實.貴州植物志(第四卷)[M].四川:四川民族出版社,1989：133-134.

[2] 劉浩，談滿良，單體江，等.博落回生物堿與生物活性及其應(yīng)用[J].中國野生植物資源， 2009，28(3)：21-23.

[3] 張小艷，黃紅梅，汪尚坤，等.博落回的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014，(23)：157-158.

[4] 趙東亮，郁建平，周曉秋，等.博落回生物堿的抑菌作用研究[J].食品科學(xué)，2005， 1：(6)：45-47.

[5] 王朝元，童勝蘭，胡鑫.博落回生物堿成分及其抗菌活性的研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報( 自然科學(xué)版)，2015.3(34):39-42.

[6] 楊軍，王靜，劉信順，等.博落回藥理研究[J].中藥材，1999，22(2)：82-84.

[7] 何亞琳．貴州省土壤硒含量及其分布[J]．土壤學(xué)報，1996，33(4)：391-397.

[8] 李詠梅，邵世和，顧世海，等.微量元素硒對金黃色葡萄球菌的抑制作用[J].吉林醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1999，19(1)：3-4.

[9] 彭曉一,可成友,吳曉芳,等.中草藥富集硒的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(7)：889-890.

[10] 楊若明，張經(jīng)華，擺亞軍，等.外源性加硒法增加棗中硒含量的研究[J].廣東微量元素科學(xué)，2001，8(1)：29-31.

[11] 程嘉翎，肖龍云，張波.外源硒對桑葉中硒及若干化學(xué)成分含量的影響[J].蠶業(yè)科學(xué)，2006，32(4)：575-577.

[12] 王珂佳，譚艾娟，劉佳穆.博落回生物堿提取工藝研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2010，29(1)：52-55.

[13] 王甘露，朱笑青.貴州省土壤硒的背景值研究[J].環(huán)境科學(xué)研究，2003，16(1)：23-26.

(編校：王冬梅)

Study on the antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata

WANG Ke-jia1, LIU Yun2, REN Yan-ling1Δ

(1.Guizhou Light Industry Technical College, Guiyang 550002, China; 2.Tongren Polytechnic College, Tongren 554300, China)

ObjectiveTo study on antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata.MethodsPenicillin sodium and saline as control, detected the average inhibition zone diameter of se-enriched Macleya cordata group (containing 0.96 mg/mL sanguinarine) on 9 common bacteria with disc agar diffusion method;20% methanol and saline as control, se-enriched Macleya cordata group which the average inhibition zone diameter was minimum, without se-enriched Macleya cordata group and penicillin sodium were diluted with 20% methanol, made concentration of 0.48,0.24,0.12,0.06, 0.03 mg/mL. minimal inhibitory concentration (MIC) of each treatment group was determined by agar dilution method, evaluated antibacterial effect of se-enriched Macleaya cordata group. Resultsse-enriched Macleya cordata group could improve antibacterial effect significantly, the average inhibition zone of 100 μg/mL sodium selenite treatment group was minimum(Φ15.33 mm);MIC of se-enriched Macleya cordata group onE.coliO1,E.coliP22,E.Dublinreduced from 0.96 to 0.24 mg/mL; MIC ofS.typhimuriumandS.suiparewere 0.12 mg/mL; MIC ofS.aureusandS.suiswere 0.06 mg/mL; MIC ofE.DublinandL.murrayiwere less than 0.03 mg/mL. ConclusionSe-enriched Macleya cordata improves the antibacterial effect signififcantly, and it lays the theoretical foundation for development and utilization of se-enriched Macleya cordata for future.

selenium-enriched;Macleya cordata; sanguinarine;antibacterial effect

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2013]2149號)

王珂佳，男，碩士，講師，教務(wù)處副處長，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：200811938@qq.com；任艷玲，通訊作者，女，博士，講師，研究方向：植物病蟲害及其防治和生態(tài)學(xué)，E-mail：43182481@qq.com。

R931.6

A

1005-1678(2015)05-0010-04