張?zhí)煳模x揚，張志，王廣樹

(吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

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鴉蔥總黃酮保肝作用的體內(nèi)外研究

張?zhí)煳?，謝揚，張志，王廣樹Δ

(吉林大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

目的 探索鴉蔥總黃酮在體內(nèi)、體外的保肝作用。 方法 體內(nèi)實驗：ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組，采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷模型和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷模型，檢測各組血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量，光鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)變化。體外實驗：原位膠原酶消化法提取分離Wistar大鼠肝細胞，采用四氯化碳誘導(dǎo)肝臟細胞損傷，鴉蔥黃酮溶液干預(yù)培養(yǎng)細胞4 h后檢測上清培養(yǎng)液中AST、ALT、LDH、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和肝細胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。結(jié)果 在四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷2組模型中，HE肝臟病理切片顯示鴉蔥總黃酮組的肝損傷明顯輕于模型組，模型組AST、ALT、LDH活性均顯著高于空白組(P<0.01)；陽性藥組上述指標(biāo)活性均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05)；鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組上述指標(biāo)活性均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05)。在四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝細胞損傷體外實驗中，模型組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著高于空白組(P<0.01)，SOD活性顯著低于空白組(P<0.01)；陽性藥組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01)，SOD活性均顯著高于模型組(P<0.01)；鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著低于模型組 (P<0.05，P<0.01)，SOD活性均顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01)。 結(jié)論 鴉蔥總黃酮對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷、卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷和大鼠肝細胞損傷有顯著的保護作用，為開發(fā)和利用鴉蔥資源、研制保肝新藥提供了實驗依據(jù)。

鴉蔥；黃酮；肝損傷

鴉蔥ScorzoneraaustriacaWild，菊科多年生草本植物，分布于中國的西北，東北地區(qū)。全草入藥，具有清熱解毒，活血消腫的功效。外用治疔瘡，癰疽，毒蛇咬傷，蚊蟲叮咬，乳腺炎等[1]。鴉蔥中的主要化學(xué)成分有：黃酮、倍半萜、三萜、香豆素類化合物[2-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明鴉蔥具有抗腹瀉、抗炎、治療由帶狀皰疹病毒引起的帶狀皰疹系水痘，治療妊娠惡阻等作用[9-11]。民間鴉蔥用來治療肝炎，具有良好的效果。為開發(fā)和利用鴉蔥藥用資源，本課題組就鴉蔥總黃酮的肝臟保護作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:ICR小鼠144只，清潔級，28～30日齡，18～22 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(吉)-2007-0003。雌性Wistar大鼠2只，清潔級，6～8周齡，150～180 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(吉)-2007-0003。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 藥材：鴉蔥藥材采自于吉林省四平地區(qū)，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張靜敏教授鑒定為鴉蔥ScorzoneraaustriacaWild。

1.1.3 主要藥品及試劑: D-101型大孔樹脂、D-4020型大孔樹脂(天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂分公司)；ALT、AST、SOD、MAD、SOD、NO試劑盒、HE染色試劑盒( 南京建成生物工程研究所)；脂多糖、IV型膠原酶、臺盼藍(Sigma公司)；卡介苗(長春生物制品所)；聯(lián)苯雙酯(北京協(xié)和制藥廠)；1640培養(yǎng)液(hyclone公司)；PBS(gibco公司)；四季青胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)。

1.1.4 實驗儀器: TGL-16C離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠；DNM-9602酶標(biāo)儀(北京普朗有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱、無菌超凈臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；BX51光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 鴉蔥總黃酮(total flavonoids in Scorzonera austriaca Wild，TFSA)的制備[2-3]：鴉蔥全草5.4 kg，用70%的乙醇浸泡，共3次，每次7 d，收集鴉蔥浸泡提取液，減壓回收乙醇，然后上D-101大孔樹脂色譜柱，先用水洗脫，除去色素、水溶性蛋白、糖類等雜質(zhì)，用60%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，干燥，得鴉蔥粗制黃酮提取物145 g。將粗制總黃酮上樣到預(yù)先處理好的D4020大孔樹脂色譜柱上，逐步用水、5%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用10%乙醇洗脫收集洗脫液，薄層色譜板監(jiān)測，至出現(xiàn)黃酮時在10%～30%之間逐步加大乙醇的百分含量洗脫，薄層色譜板監(jiān)測，洗脫至無黃酮出現(xiàn)為止，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，得到精制鴉蔥總黃酮71.5 g。

1.2.2 ICR小鼠四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷模型[12]：取ICR小鼠60只，隨機分組空白組、模型組、陽性藥組、鴉蔥總黃酮低劑量組、中劑量組和高劑量組。鴉蔥總黃酮低中高3組的灌胃劑量分別為：60、100、140 mg/kg，用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液配制。聯(lián)苯雙酯灌胃劑量為100 mg/kg?？瞻捉M和模型組用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液5 mL/kg灌胃，其余各組按給定劑量灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。除空白組外，各組末次灌胃給藥2 h后按照10 ml/kg腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液，空白組腹腔注射橄欖油，復(fù)制急性四氯化碳小鼠肝損傷模型。以小鼠血清中AST、ALT的活性為評價指標(biāo)，與空白組相比模型組顯著升高，與模型組相比陽性藥組顯著降低為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，差異性愈顯著造模效果愈好，本實驗造模成功率91%。

腹腔注射造模后禁食不禁水，待16 h后摘除眼球取血，于1.5 mL離心管中37 ℃水浴鍋水浴30 min，5000 r/min離心10 min，吸取血清至無菌的1.5 mL離心管，根據(jù)試劑盒說明書檢測小鼠血清中的AST、ALT、LDH的活性。

處死小鼠解剖分離其肝臟，將其放入預(yù)先配制好的10%的福爾馬林溶液中固定，經(jīng)梯度脫水、浸透、包埋、切片、染色、脫水透明等處理后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 ICR小鼠卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷模型[13-14]：實驗分組同1.2.2。鴉蔥總黃酮低、中、高3組的灌胃劑量分別為：80、160、240 mg/kg，用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液配制。陽性藥組聯(lián)苯雙酯灌胃劑量為150 mg/kg。除空白組外，其余各組于首次灌胃給藥前3 h尾靜脈注射卡介苗2.5 mg/只(含5×106個菌)，空白組尾靜脈注射等同體積的生理鹽水?？瞻捉M和模型組用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液5 mL/kg灌胃，其余各組按給定劑量灌胃，每天1次，連續(xù)12 d。除空白組外，其余各組末次灌胃給藥2 h后按照10 μg/只的劑量尾靜脈注射脂多糖，空白組尾靜脈注射生理鹽水，復(fù)制卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型。

AST、ALT、LDH檢查方法及HE染色切片同上。

1.2.4 四氯化碳誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞損傷模型：采用原位膠原酶消化法[15-17]分離肝細胞。Wistar大鼠禁食不禁水24 h，用2%的戊巴比妥鈉溶液按照40 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，同時腹腔注射肝素鈉溶液200 U/kg，消毒，仰臥位固定大鼠于固定板上，打開腹腔，游離出門靜脈，用一次性輸液器針頭(1.2×19TWLB)插入門靜脈，固定插入針頭，連接無菌37 ℃預(yù)熱的PBS溶液，剪斷下腔靜脈，以30 mL/min的速度灌流10 min至肝臟呈米黃色，以20 mL/min 0.05%的IV型膠原酶(PBS配制，濃度0.5 mg/mL)灌流10 min至肝臟松軟無彈性，剪切肝臟周圍的血管韌帶分離出完整的肝臟于無菌平皿中，用PBS清洗肝臟表面3次，撕去肝包膜，輕輕震蕩肝臟和平皿，肝細胞散落到4 ℃預(yù)冷的PBS溶液中，100目篩網(wǎng)過濾，得到肝細胞懸液，600 r/min離心肝細胞懸液1次，500 r/min離心肝細胞懸液2次，以洗去殘余的紅細胞，用培養(yǎng)液重懸肝細胞，臺盼藍排斥法測分離的肝細胞活力，最后用含10%胎牛血清和1%雙抗(100000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)的1640完全培養(yǎng)液在平皿中培養(yǎng)。

肝細胞培養(yǎng)4 h后，換液，調(diào)整肝細胞密度為8×106個/mL，100 μL/孔接種到48孔板中，同時鴉蔥總黃酮低、中、高3組和陽性藥組分別加入藥液100 μL，使鴉蔥總黃酮低、中、高3組的終濃度分別為0.1、0.05、0.01 mg/mL，陽性藥物聯(lián)苯雙酯的終濃度為0.01 mg/mL，空白組和模型組加入含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)2 h。除空白組外各孔加入含CCl490 mmol/L的培養(yǎng)液100 μL使其終濃度為30 mmol/L，空白組加入100 μL 1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

收集各孔上清細胞培養(yǎng)液，4000 r/min離心5 min，取上清液按各自試劑盒說明書測定AST、ALT、LDH、NO、SOD的活性。

棄去細胞培養(yǎng)上清液，用細胞刮將細胞刮下，將細胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管，加提取液0.5 mL，混勻2 min，把細胞破碎制成懸液，按試劑盒說明書測定肝細胞中MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 ICR小鼠四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷中AST、ALT、LDH活性的測定結(jié)果 在2組模型中，與空白組相比，模型組AST、ALT、LDH活性均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比陽性藥組AST、ALT、LDH活性均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，表明模型復(fù)制成功。與模型組相比，鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組AST、ALT、LDH活性均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，說明鴉蔥總黃酮對ICR小鼠四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷均有保護作用。見表1。

表1 鴉蔥總黃酮對CCl4誘導(dǎo)及卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷小鼠血清肝功能酶活性的影響±s，U/L)Tab.1 Effect of total flavonoids in Scorzonera austriaca Wild on serum ALT, AST and LDH after CCl4-and BCG+LPS-induced acute chemical liver injury in ±s，U/L)

*P<0.01，與空白組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with

2.2 光鏡下鴉蔥總黃酮對ICR小鼠四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷的影響 空白組ICR小鼠肝小葉組織結(jié)構(gòu)清晰，肝竇和肝細胞索排列整齊有序，肝細胞胞漿紅染，核呈圓形居中，匯管區(qū)三管結(jié)構(gòu)清晰可見，呈正常肝組織結(jié)構(gòu)。

在ICR小鼠四氯化碳誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷模型中，模型組ICR小鼠個別肝細胞濁腫，大部分肝細胞呈壞死改變，細胞結(jié)構(gòu)模糊不清，著色深淺不一，細胞核濃縮碎裂。陽性藥組中央靜脈周圍的部分肝細胞濁腫，表現(xiàn)為細胞腫脹呈圓形，胞質(zhì)著色淺，濁腫的肝細胞內(nèi)可見大小數(shù)量不等的圓形空泡，應(yīng)為脂肪變性所致。鴉蔥總黃酮低劑量組中央靜脈周圍的肝細胞濁腫，表現(xiàn)為細胞腫脹呈圓形，胞質(zhì)著色淺。鴉蔥總黃酮中劑量組中央靜脈周圍的部分肝細胞濁腫，表現(xiàn)為細胞腫脹呈圓形，胞質(zhì)著色淺，肝組織內(nèi)單核細胞浸潤多見。鴉蔥總黃酮高劑量組中央靜脈周圍的部分肝細胞輕度濁腫，表現(xiàn)為細胞腫脹呈圓形，胞質(zhì)著色淺，肝組織內(nèi)單核細胞浸潤多見。見圖1。

在卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷模型中，模型組個別肝細胞腫大，細胞內(nèi)有不規(guī)則無色區(qū)，為輕度水腫所致。陽性藥組個別肝細胞腫大，細胞內(nèi)有不規(guī)則無色區(qū)，為輕度水腫所致。鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組均與空白組一致。見圖1

圖1 鴉蔥總黃酮對CCl4及卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色,×200)Fig.1 The morphological changes of CCl4-and BCG+LPS-induced acute chemical hepatic injury (HE staining,×200)

2.3 鴉蔥總黃酮對四氯化碳誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞損傷的保護作用 與空白組相比，模型組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著升高(P<0.01)，SOD活性均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性均顯著升高(P<0.01)，表明模型復(fù)制成功。與模型組相比，鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組AST、ALT、LDH、MDA、NO活性均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，說明鴉蔥總黃酮對四氯化碳誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞損傷有保護作用。見表2。

表2 鴉蔥總黃酮對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝細胞中AST、ALT、LDH、MDA、NO、SOD的影響Tab.2 Effect of total flavonoids in Scorzonera austriaca Wild on ALT, AST, LDH, MDA, NO, SOD in CCl4-induced rat hepatocyte injury ±s)

*P<0.01，與空白組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 討論

本研究通過CCl4誘導(dǎo)小鼠化學(xué)性急性肝損傷、卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷等體內(nèi)模型和大鼠肝細胞損傷體外模型，考察鴉蔥總黃酮對肝臟的保護作用。在體內(nèi)實驗中，鴉蔥總黃酮低、中、高劑量組小鼠血清中AST、ALT、LDH活力明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)，說明鴉蔥總黃酮對四氯化碳造成的ICR小鼠化學(xué)性急性肝損傷和卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷均有良好的保護作用。在CCl4誘導(dǎo)小鼠化學(xué)性急性肝損傷模型中，HE肝臟病理切片顯示鴉蔥總黃酮組的肝損傷明顯輕于模型組，表明鴉蔥總黃酮對小鼠化學(xué)性急性肝損傷具有良好的保護作用；而在介苗+脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型中，HE肝臟病理切片顯示鴉蔥總黃酮組的肝肝已經(jīng)恢復(fù)到同空白對照一樣的狀態(tài)，表明鴉蔥總黃酮對小鼠免疫性肝損傷有顯著的保護作用。本實驗成功提取并培養(yǎng)了大鼠原代肝細胞，實驗結(jié)果表明鴉蔥總黃酮能顯著降低CCl4損傷的肝細胞細胞培養(yǎng)液中AST、ALT、LDH、NO、MDA的含量(P<0.05，P<0.01)，抑制培養(yǎng)液中SOD活力的降低(P<0.05，P<0.01)說明鴉蔥總黃酮對CCl4誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞損傷有顯著的保護作用。

肝損傷多數(shù)是由于外界或體內(nèi)的有毒物質(zhì)聚集于肝臟，對肝臟的功能造成一定的損傷，嚴(yán)重的情況下會導(dǎo)致肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生。肝損傷可分為化學(xué)性損傷機制和免疫性損傷機制2大類?；瘜W(xué)性損傷主要由外來的一些有毒物質(zhì)或者藥物導(dǎo)致機體內(nèi)的自由基過多，進而造成脂質(zhì)過氧化，損傷細胞膜結(jié)構(gòu)；免疫反應(yīng)在肝損傷發(fā)病機制中起著十分重要的作用特別是乙肝病毒導(dǎo)致的肝功損害和自身免疫性肝細胞損傷[18]。本實驗采用CCl4誘導(dǎo)小鼠化學(xué)性急性肝損傷模型和體外大鼠肝細胞損傷模型，初步證明了鴉蔥總黃酮對肝臟化學(xué)性損傷的保護作用?？ń槊?脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型與人類慢性肝炎的病理過程相似，以肉芽腫性炎癥侵潤、彌漫性肝細胞炎性反應(yīng)甚至壞死為病理特征，是一種典型的免疫性肝損傷，與人類免疫紊亂導(dǎo)致的肝損傷相似，同時在一定程度上還可以反映乙肝病毒HBV導(dǎo)致的肝細胞損傷機制[19-21]。實驗結(jié)果表明鴉蔥總黃酮對免疫性肝損傷有顯著的改善作用。本實驗從化學(xué)性肝損傷和免疫性肝損傷2方面初步證明了鴉蔥總黃酮保肝作用，在研制治療肝炎的新藥方面具有重要意義。

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(編校：王儼儼,譚玲)

Study on hepatoprotective effects of total flavonoids inScorzoneraaustriacaWild in vivo and in vitro

ZHANG Tian-wen, XIE Yang, ZHANG Zhi, WANG Guang-shuΔ

(School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate the hepatoprotective effects of total flavonoids inScorzoneraaustriacaWild (TFSA) in vivo and in vitro.MethodsIn vivo, ICR mice were randomly divided into negative, model, positive, TFSA’s low-dose, medium-dose and high-dose groups，and acute chemical liver injury models were constructed with CCl4and acute autoimmune liver injury models with Bacillus Calmette-Guerin vaccine (BCG ) and lipopolysaccharide (LPS).The activity of serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), lactate dehydrogenase (LDH) was detected and liver tissue was used as biopsy.In vitro, liver cells of Wistar rat were extracted and isolated by orthotopic collagenase digestion method, and liver cell damage was induced with CCl4.Then the liver cells were cultured with TFSA solution and the contents of AST, ALT, LDH, nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD) in the supernatant and malondialdehyde (MDA) in rat hepatocyte were detected.ResultsThe results of CCl4-and BCG+LPS-induced acute chemical liver injury models in mice showed that there were less microstructures damage of liver tissue in TFSA groups compared with model group in liver pathological sections (HE), AST, ALT and LDH levels in model group were significantly higher than those in negative group (P<0.01), the above indexes in positive drug group were significantly lower than those in negative group (P<0.01，P<0.05), and the above indexes in TFSA’s low-dose, medium-dose and high-dose groups were significantly lower than those in model group(P<0.01，P<0.05). The results of CCl4-induced rat hepatocyte injury in vitro showed that AST, ALT, LDH, MDA and NO levels were significantly higher and SOD level was lower in model group than those in negative group (P<0.01), AST, ALT, LDH, MDA and NO levels were significantly lower and SOD level was higher in positive drug group than those in model group (P<0.01,P<0.05), and AST, ALT, LDH, MDA and NO levels were significantly lower and SOD level was higher in TFSA’s low-dose, medium-dose and high-dose groups were significantly lower than those in model group(P<0.01，P<0.05).ConclusionTFSA have hepatoprotective effects on CCl4-induced chemical liver injury and BCG+LPS-induced immune liver injury in mice, and rat hepatocyte damage.This study provides experimental data for the development and utilization ofScorzoneraaustriacaWild resources and new hepatoprotective medicines.

ScorzoneraaustriacaWild; flavonoids; liver damage

國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制(2013ZX09103002-007)

張?zhí)煳模?，碩士，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：UFOzhangtianwen@163.com；王廣樹，通訊作者，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：wgs@jlu.edu.cn。

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1005-1678(2015)05-0006-05