劉莉莎，王悅，李京，李菲菲，范慧紅Δ

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京諾華制藥有限公司，上海 201210)

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生色底物法測(cè)定細(xì)胞色素C活力初探

劉莉莎1，王悅1，李京1，李菲菲2，范慧紅1Δ

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京諾華制藥有限公司，上海 201210)

目的 建立生色底物法測(cè)定細(xì)胞色素C活力。方法 以3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)作為底物，在37 ℃下與細(xì)胞色素C反應(yīng)15 min，終止反應(yīng)后生成黃色產(chǎn)物，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4×4量反應(yīng)平行線測(cè)定法。結(jié)果 采用生色底物法對(duì)上市細(xì)胞色素C注射劑進(jìn)行活力測(cè)定，線性回歸方程為Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996，精密度及重復(fù)性RSD值分別為1.1 %及3.6 %。結(jié)論 生色底物法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，采用相對(duì)法測(cè)活力避免了人為因素影響，初步可用于細(xì)胞色素C的活力測(cè)定。

細(xì)胞色素C；生色底物法；活力；底物；TMB

細(xì)胞色素C為細(xì)胞呼吸激活劑，屬于細(xì)胞代謝改善藥。臨床主要用于各種組織缺氧的急救或輔助治療?！吨袊?guó)藥典》2010年版二部中收載的細(xì)胞色素C活力測(cè)定方法為酶可還原率法[1]，即利用細(xì)胞色素C的氧化還原酶特性，通過(guò)細(xì)胞色素C可被酶還原數(shù)與被化學(xué)物質(zhì)還原數(shù)的吸光度之比，以此測(cè)定其活性，該方法1948年由Paul用來(lái)測(cè)定細(xì)胞色素C活性[2]。我國(guó)自1977年《中國(guó)藥典》收載細(xì)胞色素C品種開(kāi)始，一直沿用該方法測(cè)活力，至今未改變。作為傳統(tǒng)酶類(lèi)品種，細(xì)胞色素C的活力測(cè)定方法建立之后較難改變，研究者們也嘗試著對(duì)該方法做出改進(jìn)[3-6]，但仍存在一定的局限性，如新鮮的豬或牛心獲取和琥珀酸脫氫酶制備操作較繁瑣；琥珀酸脫氫酶混懸液引起吸光度的波動(dòng)以及酶活力的高低均影響細(xì)胞色素C活力測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性；有毒試劑氰化鉀的使用；為絕對(duì)法測(cè)定細(xì)胞色素C活力。

3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)在1976年被用于血紅素或含血紅素蛋白的底物檢測(cè)[7]，具有高檢測(cè)靈敏性和無(wú)致突變特性，目前已有關(guān)于細(xì)胞色素C的基礎(chǔ)研究使用TMB作為底物進(jìn)行活性測(cè)定[8-9]。本文嘗試建立了TMB生色底物法測(cè)定細(xì)胞色素C的活力，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4×4量反應(yīng)平行線測(cè)定法，并對(duì)上市細(xì)胞色素C注射劑進(jìn)行了活力測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Molecular Devices，SpectraMax Plus384連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；Mettler Toledo，XS205 Dual Range電子天平；多通道及單通道Eppendorf移液器；中國(guó)藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

TMB液體底物購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)產(chǎn)細(xì)胞色素C原料，按照法定標(biāo)準(zhǔn)方法自行標(biāo)定活力值為100 %；細(xì)胞色素C注射劑分別購(gòu)自國(guó)內(nèi)3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)作為供試品(廠家A、廠家B、廠家C)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 溶液制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品適量按照活力為100 %計(jì)算濃度，加水溶解并稀釋至log劑量-反應(yīng)線性范圍內(nèi)的4個(gè)連續(xù)濃度，一般為1.25 ～ 5.0 μg/mL，劑間比r=0.7。

1.2.2 供試品溶液：取細(xì)胞色素C注射液及注射用細(xì)胞色素C制劑，分別按照預(yù)估活力為100 %計(jì)算濃度，加水稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的4個(gè)濃度。

1.2.3 1.0 mol/L硫酸溶液：量取硫酸12.0 mL，加水稀釋至200 mL。

1.2.4 空白輔料溶液：稱取雙甘氨肽80 mg，亞硫酸鈉13.3 mg，亞硫酸氫鈉13.3 mg，加水溶解混勻并稀釋至100 mL。

1.3 活力測(cè)定 在96孔酶標(biāo)板上加樣，分別為4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(S1、S2、S3、S4)和供試品(T1、T2、T3、T4)，每個(gè)濃度平行做2孔，按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的順序加樣，加樣量10 μL。在每個(gè)加樣孔中加入TMB液體底物100 μL，置于酶標(biāo)儀中混勻，避光，37 ℃保溫15 min。取出，每孔加入1.0 mol/L硫酸溶液100 μL終止反應(yīng)。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度值。以吸光度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別作線性回歸，按生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的量反應(yīng)平行線原理4 × 4法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，回歸項(xiàng)應(yīng)非常顯著(P<0.01)，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線各項(xiàng)均應(yīng)不顯著(P>0.05)，可信限率(FL%)不大于10 %，可靠性測(cè)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)后，計(jì)算細(xì)胞色素C供試品溶液濃度，進(jìn)而計(jì)算實(shí)際活力。

1.4 專(zhuān)屬性 按照1.2項(xiàng)下方法分別配制4個(gè)連續(xù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液，同時(shí)配制輔料溶液和4個(gè)相應(yīng)濃度的牛血清白蛋白溶液，量取上述溶液各10 μL加入酶標(biāo)板，按照1.3項(xiàng)下方法測(cè)定反應(yīng)后的吸光度值。

1.5 線性 精密稱取細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水制成濃度為0.2 mg/mL的溶液，量取上述溶液1000、750、625、500、375、250、125、62.5μl分別置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加水稀釋至刻度并混勻，得到濃度依次為20.0、15.0、12.5、10.0、7.5、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列線性溶液。分別量取上述溶液各10 μL，按照1.3項(xiàng)下方法測(cè)定反應(yīng)后的吸光度值，以吸光度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，溶液濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.6 精密度及重復(fù)性 按照1.2項(xiàng)下方法分別配制4個(gè)連續(xù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及相應(yīng)濃度的供試品溶液，按照1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算活力的RSD值。

按照1.2項(xiàng)下方法，配制連續(xù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另取同一批號(hào)的供試品6份，分別配制連續(xù)濃度的供試品溶液，按照1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算6份供試品溶液活力的RSD值。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性 按照1.4項(xiàng)下方法測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液吸光度值均隨著濃度的增加而增大，而輔料溶液和不含有細(xì)胞色素C的牛血清白蛋白溶液吸光度值幾乎無(wú)變化，說(shuō)明反應(yīng)液中只有細(xì)胞色素C可以與底物發(fā)生生色反應(yīng)，而其他物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)。

表1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)吸光度結(jié)果Tab.1 Results of absorbance by the specificity test

2.2 線性 按照1.5項(xiàng)下方法得到線性回歸方程為Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996。結(jié)果顯示該方法細(xì)胞色素C溶液濃度在1.25～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3 精密度及重復(fù)性 按照1.6項(xiàng)下方法計(jì)算RSD值分別為1.1 %及3.6 %，結(jié)果顯示該方法精密度及重復(fù)性較好。

2.4 供試品活力測(cè)定結(jié)果 按照1.3項(xiàng)下方法對(duì)8批供試品的活力進(jìn)行測(cè)定，在可靠性測(cè)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)后，計(jì)算活力，結(jié)果見(jiàn)表2，同時(shí)與藥典方法測(cè)得活力結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示生色底物法比藥典方法測(cè)得結(jié)果普遍偏高。

表2 供試品活力測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of activity assay

3 討論

3.1 原理 細(xì)胞色素C是三羧酸循環(huán)中非常重要的電子傳遞體，它通過(guò)鐵卟啉輔基中鐵原子價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)變將電子由細(xì)胞色素還原酶?jìng)鬟f給細(xì)胞色素氧化酶，引起氧化還原反應(yīng)。作為氧化還原酶，細(xì)胞色素C可與底物TMB反應(yīng)生成亞胺絡(luò)合物，產(chǎn)物具有紫外吸收，且吸光度值與細(xì)胞色素C濃度成正比，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度，進(jìn)而測(cè)定細(xì)胞色素C的活力。藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測(cè)量者，稱為量反應(yīng)[10]。根據(jù)量反應(yīng)平行線測(cè)定法的原理及方法[11-14]，測(cè)定細(xì)胞色素C活力。

3.2 底物及檢測(cè)波長(zhǎng)的確立 考察了TMB和鄰苯二胺兩種底物用于測(cè)定細(xì)胞色素C的活力，發(fā)現(xiàn)鄰苯二胺需要新鮮配制，放置過(guò)程極不穩(wěn)定，易氧化使溶液顯黃色，影響吸光度測(cè)定的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，誤差較大。而TMB是市售并且按照統(tǒng)一配方配制而成，較為穩(wěn)定?？紤]到方法重現(xiàn)性和底物穩(wěn)定性，選擇TMB作為反應(yīng)底物。由于TMB在細(xì)胞色素C作用下生成亞胺絡(luò)合物，在450 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。

3.3 濃度及劑間比的確立 通過(guò)2.2線性考察結(jié)果，細(xì)胞色素C溶液濃度在1.25～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，考慮到紫外檢測(cè)的準(zhǔn)確性，選擇反應(yīng)吸光度值為0.2～1.0的溶液，對(duì)應(yīng)濃度范圍為1.25～5.0 μg/mL。

量反應(yīng)平行線原理劑間比r=1.2 ～ 2.0，在此基礎(chǔ)上比較劑間比分別為r=0.8、r=0.7、r=0.6和r=0.5時(shí)的反應(yīng)吸光度，發(fā)現(xiàn)劑間比為r=0.8時(shí)，吸光度值雖然在0.2～1.0范圍內(nèi)，但是濃度的線性范圍較窄，而劑間比為r=0.5和r=0.6時(shí)，濃度的線性范圍雖然較寬但反應(yīng)吸光度最低值均小于0.1，系統(tǒng)誤差較大。因此，綜合比較，劑間比為r=0.7時(shí)，較為合適。最終配制的溶液濃度為5.0、3.5、2.45、1.715 μg/mL。

3.4 反應(yīng)時(shí)間的確立 考察了不同反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20 min)測(cè)定的吸光度。發(fā)現(xiàn)5 min時(shí)反應(yīng)不完全，加入終止液后吸光度值仍波動(dòng)較大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10、15、20 min時(shí)加入終止液，測(cè)得吸光度值較為穩(wěn)定，綜合考慮反應(yīng)的充分性及時(shí)間成本，選擇中間時(shí)間15 min作為反應(yīng)時(shí)間。

3.5 與藥典方法比較 本研究嘗試建立的TMB生色底物法采用標(biāo)準(zhǔn)品及量反應(yīng)平行線原理檢測(cè)細(xì)胞色素C的相對(duì)活力，并應(yīng)用于制劑的檢測(cè)，該方法排除了人為因素的影響；通過(guò)交叉加樣順序，避免了由加樣順序引起的誤差；采用平行線原理計(jì)算4種梯度濃度的細(xì)胞色素C活力，而不是測(cè)定單一濃度的活力，結(jié)果更為全面可靠；計(jì)算所得幾項(xiàng)參數(shù)(回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線的P值)能夠表征結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。但由于TMB底物法對(duì)含有血紅素的蛋白酶類(lèi)均可以進(jìn)行活性測(cè)定，因此對(duì)于細(xì)胞色素C原料及其制劑需在進(jìn)行理化鑒別及紫外特征吸收峰鑒別符合規(guī)定后進(jìn)行TMB生色底物法的活力測(cè)定。通過(guò)與藥典方法測(cè)得的結(jié)果比較(見(jiàn)表2)，可以看出，生色底物法測(cè)得的結(jié)果比藥典方法測(cè)得的結(jié)果普遍偏高，這可能與標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)化為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部自行標(biāo)定，未進(jìn)行更合理的協(xié)作標(biāo)定而導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示量不夠精確有關(guān)。

綜上所述，本研究嘗試建立了生色底物法測(cè)定細(xì)胞色素C活力，并采用該方法對(duì)上市的細(xì)胞色素C注射劑進(jìn)行了活力測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高，減少了人為因素的影響，避免了有毒試劑的使用，可用于細(xì)胞色素C活力測(cè)定。方法的影響因素及結(jié)果可靠性還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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(編校：王冬梅)

Determination of the activity of cytochrome C by the chromogenic substrate method

LIU Li-sha1, WANG Yue1, LI Jing1, LI Fei-fei2, FAN Hui-hong1Δ

(1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2.Beijing Novartis Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China)

ObjectiveTo establish the chromogenic substrate method to determine the activity of cytochrome C.MethodsUsed TMB as the chromogenic substrate, reacted at 37 ℃ for 15 min, generated the yellow products, and detected the absorbance at 450 nm.The experimental design method is the 4×4 parallel line quantitative analysis.ResultsThe activities of cytochrome C injection samples have been determined.The linear regression equation was Y=0.9875 X - 1.0221，R2=0.9996.The accuracy and repeatability were 1.1 % and 3.6 %.ConclusionThe chromogenic substrate method was simple operation, sensitive and can be used to determine the activity of cytochrome C.

cytochrome C; chromogenic substrate method; activity; substrate; TMB

劉莉莎，女，碩士，主管藥師，研究方向：酶類(lèi)生化藥物質(zhì)量控制，E-mail：Jzllisha@163.com范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥物質(zhì)量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R719

A

1005-1678(2015)07-0138-03