李京，王悅，劉莉莎，任雪，范慧紅

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

?

凝乳酶效價測定方法研究

李京，王悅，劉莉莎，任雪，范慧紅Δ

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 考察凝乳酶效價測定方法的影響因素，改進凝乳酶效價測定方法；考察凝乳酶國家標準品穩(wěn)定性、適用性。方法 考察不同奶粉底物和酶濃度對凝乳酶效價測定的影響；建立3×3量反應平行線法，并對多批樣品進行測定，結(jié)果與絕對法、單點相對法進行比較；使用絕對法和統(tǒng)計分析對凝乳酶標準品穩(wěn)定性進行考察；通過量反應平行線法考察凝乳酶標準品的適用性。結(jié)果 不同奶粉底物對絕對效價的測定有顯著性影響；酶濃度與凝乳時間呈冪函數(shù)關(guān)系；與絕對效價比較，相對效價在不同實驗室間結(jié)果重現(xiàn)性更好；3×3量反應平行線法測定劑量為0.35、0.44、0.55 U/mL，可信限率小于5%；凝乳酶國家標準品(140712-201302)2015年效價測定結(jié)果與2013年結(jié)果無統(tǒng)計學意義；在一定劑量范圍內(nèi)，凝乳酶國家標準品與復合凝乳酶或羔羊胃提取物的劑量-反應呈直線關(guān)系，2直線平行。結(jié)論 凝乳酶效價測定影響因素多，通過標準品測定相對效價可以消除不同底物、不同人員操作、終點判斷等因素對測定的影響，使實驗室之間結(jié)果具有可比性；3×3量反應平行線法的實驗設計可以更好的控制實驗誤差；凝乳酶國家標準品(140712-201302)穩(wěn)定性良好，適用于復合凝乳酶和羔羊胃提取物的凝乳效價測定。

凝乳酶；效價；復合凝乳酶；羔羊胃提取物；量反應平行線法

凝乳酶是一種從未斷奶的小牛胃中發(fā)現(xiàn)的天冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學功能是可專一地切割乳中κ-酪蛋白的苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)105-甲硫氨酸(methionine，Met)106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使乳凝結(jié)[1-3]。凝乳酶的來源廣泛，最早來源于小牛的第四胃，隨后在其他哺乳動物的胃中也提取了凝乳酶，許多植物中也含有能使乳凝固的蛋白酶，如菠蘿蛋白酶等， 另外還有微生物發(fā)酵及基因工程凝乳酶。凝乳酶由323個氨基酸殘基組成多肽鏈，相對分子質(zhì)量為35622 D，等電點為pH 4.5，干燥物活性穩(wěn)定，水溶液不穩(wěn)定。凝乳酶廣泛的應用于乳酪生產(chǎn)等食品加工業(yè)，在醫(yī)藥行業(yè)也有所應用。

國家食品藥品監(jiān)督管理局批準了復合凝乳酶國家標準〔WS-10001-HD(0856)-2002〕[4]和羔羊胃提取物國家標準〔WS-1001-(HD-1538)-2005〕。復合凝乳酶為“以羔綿羊第四胃為主的提取物”，羔羊胃提取物為“羔綿羊第四胃經(jīng)低溫提取制得的總提取物”，上述2種藥品主要用于治療急慢性胃炎、消化不良及嬰兒吐奶等，2個品種的曾用名均為“胃優(yōu)樂”。

復合凝乳酶和羔羊胃提取物的國家標準中凝乳酶效價測定方法基本一致，為“相對法”，即“30 ℃，通過比較標準品與供試品使10 mL 120 g/L奶粉底物凝結(jié)的時間計算效價”。胃優(yōu)樂的標準為地方標準，收載于1987年版《新疆維吾爾自治區(qū)藥品標準》[5]，標準中凝乳活性測定方法不使用標準品，為“絕對法”，即“30 ℃，每100秒中內(nèi)凝結(jié)10 mL 120 g/L奶粉底物的酶量為一凝乳單位”。

凝乳酶效價測定的影響因素很多[6-7]，如底物測、溫度、pH、金屬離子、終點觀察等，測定誤差較大。本文對凝乳酶效價測定方法的影響因素進行考察，建立3×3量反應平行線法測定凝乳酶效價，對不同實驗室、不同效價測定方法進行結(jié)果比對，考察凝乳酶國家標準品的穩(wěn)定性、適用性，為酶類藥物國家藥品標準提高和標準品標定提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器：數(shù)控精密恒溫水浴(西班牙Precisdig公司)；Mettler Toledo XS-205電子天平、Mettler Toledo MP230 pH計(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.1.2 藥品與試劑：凝乳酶國家標準品(中國食品藥品檢定研究院，效價為881 U/g，批號140712-201302)；羔羊胃提取物(新疆生化藥業(yè)有限公司，批號131212)；羔羊胃提取物維B12膠囊(新疆生化藥業(yè)有限公司，批號1403009)；復合凝乳酶膠囊(唐山葵花藥業(yè)，批號15010001)。

全脂奶粉(河北產(chǎn))，雀巢全脂奶粉(雙城雀巢有限公司)，三宇全脂奶粉(新疆焉耆三宇實業(yè)有限責任公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

① 磷酸鹽緩沖液(pH 6.3)：取磷酸二氫鈉7.8 g，磷酸氫二鈉2.7 g，加水溶解并稀釋成1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至(6.3±0.05)。

② 氯化鈣溶液：取醋酸鈉2.05 g，氯化鈣1.11 g，加水使溶解成1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至(6.3±0.1)。

③ 底物溶液：取全脂奶粉12 g，加氯化鈣溶液適量，研磨均勻，置100 mL量瓶中，加氯化鈣溶液至刻度，搖勻，使用8層脫脂紗布過濾，臨用新制。

④ 標準品溶液：取凝乳酶國家標準品(140712-201302)0.05 g，精密稱定，置研缽中，加磷酸鹽緩沖液(pH 6.3)0.5 mL，研磨均勻，用移液器分次轉(zhuǎn)移置10 mL量瓶中(約4.4 U/mL)，加磷酸鹽緩沖液(pH 6.3)稀釋至刻度，分別取上述溶液0.8、1.0、1.25 mL，置10 mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液(pH 6.3)稀釋至刻度，3個劑量組約為0.35、0.44、0.55 U/mL，劑間比r=0.8，4 ℃冰箱保存，配制后2h內(nèi)使用。

⑤ 供試品溶液：精密稱定羔羊胃提取物0.088 g(估計效價500 U/g)，照標準品溶液制備方法制備；取羔羊胃提取物維B12膠囊 10粒，分別稱內(nèi)容物重量，計算平均裝量；精密稱定內(nèi)容物約0.44 g(估計效價100 U/g)，精密稱定，照標準品溶液制備方法制備；取復合凝乳酶膠囊10粒，分別稱內(nèi)容物重量，計算平均裝量，取內(nèi)容物約0.15 g(估計效價300 U/g)，照標準品溶液制備方法制備；4 ℃冰箱保存，臨用新制。

1.2.2 凝乳活力測定法：精密量取底物溶液10 mL，置試管中，在 30 ℃±0.5 ℃ 恒溫水浴中保溫10 min，精密加入標準品溶液1 mL，搖勻并立即計時，用玻璃棒不斷蘸取溶液沿管壁流下，使成均勻薄層，當薄層出現(xiàn)可見顆粒時，表明已經(jīng)凝乳，準確記錄自標準品溶液加入后至出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象的時間。重復測定3次，3次測定值的相對標準偏差不得大于5%。取平均值作為標準品溶液的凝乳時間。取供試品溶液1 mL，依法操作。凝乳時間與凝乳酶活力呈反比，調(diào)整標準品和供試品濃度將凝乳時間應控制在180～240 s。

1.2.3 凝乳活力計算方法

① 絕對法：按1987年版《新疆維吾爾自治區(qū)藥品標準》中胃優(yōu)樂凝乳活性計算方法計算，即“30 ℃，每100秒中內(nèi)凝結(jié)10 mL 12%奶粉底物的酶量為一凝乳單位”，公式如下：

凝乳酶活力(U/g)=100(s)/[凝乳時間(s)×供試品溶液濃度(g/mL)×供試品溶液取樣體積(mL)]

② 單點相對法：按復合凝乳酶國家標準〔WS-10001-HD(0856)-2002〕中凝乳活性計算方法計算，即“30 ℃，通過比較標準品與供試品使10 mL 12% 奶粉底物凝結(jié)的時間計算效價”，公式如下：

凝乳酶活力(U/g)=[標準品溶液凝乳時間(s)×標準品標示效價(U/g)×標準品溶液濃度(g/mL)]/[供試品溶液凝乳時間(s)×供試品溶液濃度(g/mL)]

③ 量反應平行線法：使用《中國藥典》2010年版二部附錄XI V生物檢定統(tǒng)計法中3×3量反應平行線測定，即3個標準品劑量組和3個供試品劑量組，比較其在30 ℃條件下，使10 mL 120 g/L 奶粉底物溶液凝結(jié)的時間，劑量0.35、0.44、0.55 U/mL，劑間比r=0.8。BS2000軟件計算，實驗可靠性測驗結(jié)果需通過(回歸項應非常顯著P<0.01，偏離平行不顯著P>0.05，二次曲線不顯著P>0.05，反向二次曲線不顯著P>0.05)，平均可信限率FL%應小于5%。

2 結(jié)果

2.1 底物對凝乳酶活力測定的影響 分別使用3種奶粉底物測定凝乳酶國家標準品(140712-201302)的絕對法效價，見表1，圖1。結(jié)果表明不同奶粉底物對于絕對效價的測定有影響，welch檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學意義。

表1 凝乳酶國家標準品(140712-201302)不同底物凝乳酶絕對效價

#P<0.01，與河北奶粉相比，compared with Hebei milk powder；*P<0.01，與雀巢奶粉相比，compared with Nestle milk powder

圖1 凝乳酶國家標準品(140712-201302)不同奶粉底物測定絕對效價廂線圖Fig.1 Box plot of the absolute potency of chymosin national standard (140712-201302) by different formula milk powder substrates

2.2 酶濃度與凝乳時間關(guān)系 測定了凝乳酶標準品(140712-201302)9個濃度的凝乳時間。對濃度(C)-凝乳時間(T)擬合線性，符合冪函數(shù)曲線(見圖2A)，線性方程為T=99.498C-0.861，r=0.9951；對LOG濃度與LOG凝乳時間擬合線性曲線，符合直線方程(見圖2B)，線性方程為LogT=-0.861 4LogC+1.997 8，r=0.995 1。

圖2 凝乳酶標準品溶液濃度與凝乳時間關(guān)系圖A：凝乳酶標準品濃度與凝乳時間擬合冪函數(shù)曲線；B：凝乳酶標準品濃度與Log凝乳時間擬合直線Fig.2 The relationship between the concentration of the national standard of chymosin and the time of milk clotting timeA:The power function curve of the concentration of the national standard of chymosin and time of the milk clotting time; B:The line of Log concentration of the national standard of chymosin and Log time of milk clotting

2.3 凝乳酶標準品

2.3.1 國家標準品建立：復合凝乳酶和羔羊胃提取物國家標準分別于2002年和2005年頒布，首批凝乳酶國家標準品(140712-200901)于2010年發(fā)放使用，在此之前，生產(chǎn)企業(yè)使用SIGMA公司的凝乳酶標準試劑(Rennin from calf stomach，貨號R4877)為標準品指導生產(chǎn)。SIGMA公司凝乳酶純度很高，凝乳活力大于20 000 U/g，與國內(nèi)產(chǎn)品工藝及結(jié)構(gòu)有很大區(qū)別，國內(nèi)復合凝乳酶及羔羊胃提取物均為混合物，凝乳活力較低，約800 U/g，根據(jù)標準物質(zhì)與供試品相似的原則[9-10]，用含組分與供試品相似的原料為凝乳酶國家標準品是適合的。首批凝乳酶國家標準品在上述2種國內(nèi)產(chǎn)品中選擇一批性質(zhì)穩(wěn)定的原料藥作為標準品原料，以現(xiàn)行有效的SIGMA公司凝乳酶標準試劑為標準品，按國家標準(WS-10001-HD[0856]-2002)中規(guī)定的方法，經(jīng)多次實驗后賦值。

2.3.2 標準品適用性考察：以凝乳酶國家標準品(140712-201302)為標準品，采用“3×3量反應平行線法”對羔羊胃提取物和復合凝乳酶進行測定，在一定劑量范圍內(nèi)，劑量-反應呈直線關(guān)系，2直線平行見圖3、圖4。凝乳酶國家標準品(140712-201302)適用于羔羊胃提取物和復合凝乳酶原料及制劑的凝乳酶活性測定。

圖3 羔羊胃提取物凝乳酶活力測定量-反應平行線S：凝乳酶國家標準品(140712-201302)；T1：羔羊胃提取物(131212)；T2：羔羊胃提取物維B12膠囊(1403009) Fig.3 Dose-response parallel line of chymosin potency determination of lamb’tripe extractS:National standard of chymosin(140712-201312); T1:lamb’tripe extract(131212); T2:lamb’tripe extract and vitamin B12 capsule(1403009)(注：為使作圖時擬合直線的平行性更加清楚的顯示，將T1平行向左移動0.1 U/mL，將T2平行向左移動0.2 U/mL)

圖4 復合凝乳酶凝乳酶活力測定量-反應平行線S：凝乳酶國家標準品(140712-201302)；T3：復合凝乳酶膠囊(15010001)Fig.4 Dose-response parallel line of chymosin potency determination of l gastropylor complexS:National standard of chymosin(140712-201312); T3:gastropylor complex capsule(15010001)(注：為使作圖時擬合直線的平行性更加清楚的顯示，將T3平行向左移動0.1 U/mL)

2.3.3 標準品穩(wěn)定性考察：結(jié)果表明凝乳酶標準品(140712-201302)絕對效價2013年為(976±13.0)U/g (n=15)，2015年為(990±68.1)U/g (n=24)， welch檢驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖5 凝乳酶國家標準品(140712-201302)不同時間測定絕對效價廂線圖Fig.5 Box plot of the absolute potency of chymosin national standard (140712-201302) in different years

3 討論

3.1 凝乳酶凝結(jié)牛奶過程[1]牛奶中主要有4種酪蛋白分子：α-s1、α-s2、β和κ。α和β酪蛋白是疏水的蛋白質(zhì)，可被鈣沉淀，而κ-酪蛋白不能被鈣沉淀。當酪蛋白分泌時，它們自我聯(lián)合擴大形成微膠粒，在微膠粒中，α和β酪蛋白在κ-酪蛋白作用下保持非沉淀狀態(tài)，κ-酪蛋白通常能保持牛奶中的大部分蛋白為可溶的，并防止它們自發(fā)凝結(jié)。凝乳酶可以水解并使κ-酪蛋白失活，將它轉(zhuǎn)化成ρ-κ-酪蛋白和一種被稱為巨肽的蛋白。ρ-κ-酪蛋白不能穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)，而且能使不溶的蛋白質(zhì)沉淀形成凝結(jié)。

3.2 凝乳酶活力測定影響因素考察 酶促反應受各種因素影響，對反應條件極為敏感。據(jù)文獻報道[6-7]，羔羊胃提取物中凝乳酶活力受溫度、pH、金屬離子、底物濃度等影響，在35 ℃以下穩(wěn)定性較好，在30 ℃～45 ℃，隨溫度的升高，凝乳活力逐漸增大；在底物pH 5.5～7.5，凝乳活力隨著pH的增大而降低，pH大于6.0時，凝乳活力變化不大；Al3+、Ca2+、Na+有較強的促凝作用，Cu2+、Zn2+、有明顯的抑制酶活作用，K+、Mg2+、Mn2+、Fe3+對酶活力沒有明顯影響；底物濃度越大，凝乳活力越高，當?shù)孜餄舛刃∮?00 g/L時，隨著底物濃度的增大，凝乳活力增加較快。復合凝乳酶和羔羊胃提取物國家標準中已經(jīng)嚴格控制了反應溫度為30 ℃±0.5 ℃，pH為(6.3±0.1)，奶粉底物濃度為120 g/L，凝乳時間為180 s～240 s，但酶濃度的規(guī)定有所不同，復合凝乳酶為“0.4～0.6 U/mL”，羔羊胃提取物“約為1 U/mL”。在影響酶促反應的各種因素中，酶與底物是2個最基本的因素，其他因素也是通過這2者產(chǎn)生影響[8]，因此本研究對不同奶粉底物和酶濃度進行了進一步研究。

3.3 標準品穩(wěn)定性考察 凝乳酶標準品(140712-201302)是以相對法賦值的，標定時使用的SIGMA標準品現(xiàn)已過期，不能繼續(xù)使用；不同批SIGMA標準品賦值有一定誤差，不宜使用SIGMA標準品對本品穩(wěn)定性進行考察；因此本研究使用了標定時采用的河北奶粉為底物，采用絕對法對標準品的賦值進行考察。

3.4 凝乳酶活力測定方法比較

3.4.1 絕對法：“絕對法”測定受實驗條件、人員操作、終點觀察等多個因素影響，尤其是標準中不規(guī)定奶粉底物的品牌，造成實驗室之間結(jié)果重現(xiàn)性差。

3.4.2 單點相對法：使用標準品的“相對法”，很好的避免了因底物等實驗條件不同對實驗結(jié)果的影響，使實驗室之間的結(jié)果具有可比性。

3.4.3 量反應平行線法：當供試品與標準品的活性組分基本相同時，在一定劑量范圍內(nèi)，劑量-反應呈直線關(guān)系，2直線平行。本研究在單點相對法的基礎上，建立了3×3量反應平行線法測定凝乳酶效價。根據(jù)3.2.2酶濃度與凝乳時間關(guān)系的實驗結(jié)果，本研究對反應濃度進行了選擇。當酶濃度小于0.3 U/mL時，凝乳時間超過240 s，實驗時間較長，奶粉底物溶液容易發(fā)生自發(fā)凝結(jié)，終點觀察困難；當酶濃度大于0.6 U/mL 時，凝乳時間小于150 s，擬合直線趨于平直，斜率變小，反應靈敏度下降，實驗誤差大；因此本研究選擇了0.35、0.44、0.55 U/mL 3個濃度作為量反應平行性法的反應濃度?！?×3量反應平行線法”考慮到了3個不同濃度，并且應用生物統(tǒng)計工具，對標準品與供試品的平行性和實驗誤差進行了更好的控制，本研究多次實驗的結(jié)果均通過了線性、平行性的實驗可靠性檢測，可信限率均小于5%，“3×3量反應平行線法” 與“單點相對法”檢測結(jié)果基本一致。

綜上所述，凝乳酶效價測定影響因素多，通過標準品測定相對效價可以消除不同底物、不同人員操作、終點判斷等因素對測定的影響，使實驗室之間結(jié)果具有可比性；3×3量反應平行線法的實驗設計可以更好的控制實驗誤差；凝乳酶國家標準品(140712-201302)穩(wěn)定性良好，適用于復合凝乳酶和羔羊胃提取物的凝乳效價測定。

致謝：新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所提供部分樣品及檢驗數(shù)據(jù)，在此表示感謝！

[1] 張紅梅，劉鐘濱.凝乳酶的研究進展[J].同濟大學學報，2004，25(3)：254-257.

[2] Qian S,Xi PW,Qiao JY,et al.Purification and characterization of a chymosin from rhizopus microspores var.rhizopodiformis[J].Appl Biochem Biotechnol,2014,174(1)：174-185.

[3] 高維東，宋禮，紀銀莉，等.微小毛霉凝乳酶的分離純化研究[J].微生物學雜志，2012，32(2)：21-25.

[4] 國家藥品標準[S].第九冊.2002: 205-206.

[5] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.新疆維吾爾自治區(qū)藥品標準[S].1987: 113-115.

[6] 徐明生，王畢妮，張富新.羔羊雛胃酶凝乳特性的研究[J].華北農(nóng)學報，2005，20(6)：103-106.

[7] 張富新.不同因素對羔羊皺胃酶凝乳活性的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2001，17(4)：111-114.

[8] 吳梧桐，袁勤生，徐寒梅.酶類藥物學[S].第一版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：21-29.

[9] 周海鈞.生物標準物質(zhì)的建立及其要求[J].中國藥學雜志，1993，28(2)：108-110.

[10] 丁麗霞，周海鈞.生物標準物質(zhì)的研究和技術(shù)要求[J].中國藥師，2007，10(3)：229-235.

(編校：王冬梅)

Study on determination methods of chymosin potency

LI Jing, WANG Yue, LIU Li-sha, REN Xue, FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo investigate the influencing factors and improve potency methods of chymosin, to verify the stability and applicability of the national standard of chymosin.MethodsThe effects of different formula milk powder substrate and enzyme concentration on the determination of the activity of chymosin were studied.3×3 dose-response parallel line method was established.The results were compared with the different methods of absolute and relative methods.ResultsThe different formula milk powder had a significant effect on the determination of the absolute potency of the activity of chymosin.The concentration of the enzyme was a power function relationship with the milk clotting time.Compared with the absolute potency, reproducibility of the relative potency of the results was better in different laboratories.The suitable doses in 3×3 dose-response parallel line method were 0.35,0.44,0.55U/mL.The confidence limit rate was less than 5%.The potency of the national standard of chymosin (140712-201302) was not significantly different between 2013 and 2015.In a certain dose range, the dose-response of the national standard of chimosin and gastropylor complex or lamb’tripe extract was linear, and the two lines were parallel.ConclusionA lot of factors can affect on the potency of chymosin.Relative potency is determinate by reference standard which can eliminate the influence of different substrates, different operators and endpoint judgment on the determination in order to make results have comparability between laboratories.The test design of 3×3 dose-response parallel line can control the test deviation better than the single point determination.The stability of the national standard of chymosin(140712-201302) is good, and is suitable for the potency of chymosin of the products of gastropylor complex and the extract of the lamb.

chymosin;potency;gastropylor complex;lamb’tripe extract;dose-response parallel line method

李京，女，本科，副主任藥師 研究方向：生化藥物質(zhì)量控制，E-mail：lijing317@nifdc.org.cn；范慧紅，通信作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥物質(zhì)量控制，E-mail：shihuayaoshi@126.com。

TS201.25

A

1005-1678(2015)10-0118-04