畢月，隋佳琪，喬瑞紅，謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

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大黃素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制研究

畢月，隋佳琪，喬瑞紅，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 研究大黃素對(duì)MRSA41577菌株細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸的影響，探討其對(duì)MRSA的抑菌作用機(jī)制。方法 采用TTC法測(cè)定大黃素對(duì)MRSA41577的抑制作用；檢測(cè)細(xì)胞電導(dǎo)率和大分子含量確定大黃素對(duì)MRSA41577細(xì)胞膜的影響；SDS-PAGE檢測(cè)大黃素對(duì)MRSA41577可溶性蛋白的影響；DAPI染色法測(cè)定大黃素對(duì)MRSA41577核酸含量的影響；紫外吸收光譜分析法檢測(cè)大黃素與DNA的相互作用方式。結(jié)果 大黃素對(duì)MRSA41577菌株具有顯著的抑制作用，其最低抑菌濃度為8 μg/mL。8 μg/mL的大黃素作用菌體6h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞大分子和電導(dǎo)率分別增加了(71.48±0.026)%(P<0.01)和(2.39±0.102)%(P<0.05)。8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h，菌體可溶性蛋白的含量與對(duì)照組相比降低了32.8%(P<0.01)，DNA和RNA含量分別降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)和(6.67±0.36)%(P<0.05)。紫外吸收光譜結(jié)果顯示，大黃素可與DNA發(fā)生結(jié)合，其結(jié)合方式為氫鍵結(jié)合。結(jié)論 大黃素對(duì)MRSA的抑制作用機(jī)制主要是破壞菌體細(xì)胞膜，通過(guò)氫鍵結(jié)合干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成，從而破壞菌體的生物學(xué)功能。

大黃素；MRSA；抑菌；機(jī)制

抗生素的濫用使得耐藥菌株大量出現(xiàn)，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin Staphyloccocusn aureus，MRSA)在臨床上最為普遍，有“超級(jí)細(xì)菌“之稱。MRSA可在人源和動(dòng)物源細(xì)菌間傳播，給臨床治療帶來(lái)極大的麻煩[1]，因此尋找高效、無(wú)毒、不易產(chǎn)生耐藥性的抑制MRSA的藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前從中藥中篩選抗MRSA的藥物是主要的來(lái)源之一。大黃素是中藥大黃的有效單體，主要來(lái)源于蓼科植物掌葉大黃、虎杖的根莖和根中。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，大黃素具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑菌、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)等活性[2]。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示，大黃素能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，具有抗凋亡作用，且對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有明顯的促進(jìn)作用[3]。已有的研究結(jié)果顯示，大黃素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌等都具有較好的抑制作用[4-6]。但目前關(guān)于大黃素對(duì)MRSA的抑制作用研究較少，因此本文通過(guò)測(cè)定大黃素對(duì)MRSA41577菌株的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸的影響，來(lái)闡述大黃素抑制MRSA的作用機(jī)制，旨在為開(kāi)發(fā)抗MRSA藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株MRSA41577：由吉林醫(yī)大二院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 LB液體培養(yǎng)基、DAPI染料購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。大黃素(純度≥98%)，購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。pBR322購(gòu)自寶生物(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器DDS-307A(DDB-600)型電導(dǎo)率儀；UV-1102紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)；電泳凝膠定量分析系統(tǒng)(TRANSILLUMZNATOR 2020D)；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 大黃素對(duì)MRSA最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：取96孔板，分別加入90 μL MRSA菌懸液(107個(gè)/mL)和10 μL濃度為10、20、40、80、160、320 μg/mL的大黃素(終濃度分別為1、2、4、8、16、32 μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另以大黃素的助溶劑無(wú)水乙醇為對(duì)照。于37 ℃ 120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，之后每孔加入20 μL 0.2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，再在37 ℃ 120 r/min避光培養(yǎng)4 h，觀察96孔板中液體顏色變化情況。活菌數(shù)量越多，則液體紅色越深。

1.2.2 大黃素對(duì)MRSA大分子和電導(dǎo)率的影響：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的MRSA菌懸液(107個(gè)/mL)按2%的接種量加到40 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入32 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL，以大黃素助溶劑無(wú)水乙醇為對(duì)照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8 h時(shí)取8 mL菌懸液，4500 r/min離心5 min，取上清液，直接用電導(dǎo)率儀測(cè)定各組電導(dǎo)率的變化情況。大分子含量測(cè)定：取12 mL MRSA二代菌懸液離心，去上清，用PBS洗2次，加入10 mL PBS制成菌懸液，分到2個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶加入15 mL PBS，向其中一瓶加入16 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL。以大黃素助溶劑無(wú)水乙醇為對(duì)照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養(yǎng)。取培養(yǎng)至0、2、4、6、8h的菌懸液3 mL，4500 r/min離心5 min，取上清，UV-1102紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)直接測(cè)定大分子的變化情況。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 大黃素對(duì)MRSA可溶性蛋白的影響：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的MRSA菌懸液(107個(gè)/mL)按2%的接種量加到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入16 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL，以大黃素助溶劑無(wú)水乙醇為對(duì)照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養(yǎng)16 h。稱100 mg菌體，提取總蛋白，取40 μL蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用電泳凝膠系統(tǒng)蛋白分析軟件，定量分析各組菌體蛋白質(zhì)的變化。

1.2.4 大黃素對(duì)MRSA中核酸含量的影響：取1.2 mL經(jīng)8 μg/mL大黃素分別作用14、16、18、20 h的MRSA菌懸液，以加助溶劑無(wú)水乙醇為對(duì)照組(測(cè)定時(shí)調(diào)整對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的OD值一致)。加入3倍體積的DAPI染色液(CDAPI=0.8 μg/mL)。避光振蕩10 min，于DNA的激發(fā)波長(zhǎng)364 nm和RNA的激發(fā)波長(zhǎng)400 nm下，用Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定菌體的DNA和RNA的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 大黃素與DNA的相互作用：于pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中加入1.5 μL濃度為10 mg/mL大黃素，使其終濃度為10 μg/mL，然后分別加入0、0.9、1.5、2.1 μL母液濃度為0.5 μg/ μL的pBR322使其終濃度分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL，用pH7.4的Tris-HCl緩沖液將反應(yīng)總體系補(bǔ)為1.5 mL。37 ℃水浴鍋中溫育30 min后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)MRSA41577的抑制作用 TTC的染色結(jié)果顯示，隨著大黃素濃度的增加，溶液顏色由紅逐漸變淺，表明大黃素對(duì)MRSA41577有一定的抑制作用，且呈濃度依賴性。當(dāng)大黃素濃度>8 μg/mL時(shí)，溶液均變?yōu)闊o(wú)色，表明大黃素可完全抑制MRSA41577的生長(zhǎng)，其MIC為8 μg/mL。見(jiàn)表1。

表1 大黃素對(duì)MRSA41577的抑制作用Tab.1 Inhibit effect of emodin on MRSA41577

“+++”為紅色，Red；“++”為粉紅色，Peach pink；“+”為粉色，Pink；“-”為無(wú)色，Colorless

2.2 大黃素對(duì)MRSA41577細(xì)胞膜的影響 電導(dǎo)率的改變可以反映藥物對(duì)細(xì)胞膜滲透性的影響[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素對(duì)培養(yǎng)液的電導(dǎo)率和大分子含量影響顯著，8 μg/mL的大黃素作用菌體6 h后，與對(duì)照組相比，大分子DNA和RNA含量從(0.249±0.021)增加到(0.427±0.019)，增加了(71.48±0.026)%(P<0.01，見(jiàn)圖1A)，電導(dǎo)率從(15.92±0.18)ms/cm增加到(16.3±0.11)ms/cm，增加了(2.39±0.102)%(P<0.05，見(jiàn)圖1B)。該結(jié)果表明，大黃素能破壞MRSA菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體內(nèi)的無(wú)機(jī)離子和大分子的外流。

圖1 大黃素對(duì)MRSA41577大分子(A)和電導(dǎo)率(B)的影響(n=3)Fig.1 Effect of EM on macromolecules and conductivity against MRSA41577(n=3)

2.3 大黃素對(duì)MRSA41577可溶性蛋白的影響 蛋白分析軟件測(cè)定結(jié)果表明，8 μg/mL的大黃素作用供試菌株16 h后，菌體內(nèi)可溶性蛋白的含量從160.51 ng降低到107.86 ng，降低了32.8%(P<0.01)，見(jiàn)圖2、圖3。表明大黃素能夠明顯抑制菌體可溶性蛋白的合成。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)大黃素對(duì)MRSA41577蛋白合成的影響Fig.2 Effect of EM on the soluble protein against MRSA41577 by SDS-PAGE

圖3 大黃素對(duì)MRSA41577蛋白含量的影響Fig.3 Effect of EM on the content of MRSA41577 protein

2.4 大黃素對(duì)MRSA41577核酸含量的影響 DAPI染色結(jié)果顯示，大黃素能夠降低菌體內(nèi)DNA和RNA的含量，與對(duì)照組相比，8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，DNA含量從(125.89±2.36)下降到(119.825±1.14)，降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)。RNA含量從(30.268±0.624)下降到(28.248±0.31)，降低了(6.67±0.36)%(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 大黃素對(duì)MRSA41577核酸含量的影響(n=3)Fig.4 Effect of EM on the synthesis of nucleic acid against MRSA41577(n=3)

2.5 大黃素與DNA的作用方式 紫外吸收光譜結(jié)果顯示，10 μg/mL大黃素與不同濃度的PBR322(終濃度分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL)作用30 min，隨著DNA濃度的增加，大黃素的紫外吸收值逐漸增加，出現(xiàn)了明顯的增色效應(yīng)，表明大黃素與DNA結(jié)合方式為氫鍵結(jié)合。見(jiàn)圖5。

圖5 大黃素對(duì)DNA吸收光譜的影響1～4：分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL的pBR322Fig.5 Effect of EM on the absorption spectrometric titrations with DNADifferent concentrations (1～4：0、0.3、0.5、0.7 μg/mL) of PBR322

3 討論

MRSA是醫(yī)院感染的主要病原菌之一[8-9]，目前，臨床上使用的抗MRSA藥物仍然存在很大的局限性，因此獲得能抑制MRSA的藥物是解決臨床細(xì)菌感染的有效方法之一。Cao等[10]研究表明，虎杖根狀莖乙醚萃取物能夠顯著抑制MRSA的生長(zhǎng)，而大黃素是虎杖根狀莖的主要成分，因此本文對(duì)大黃素抑制MRSA41577的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究。TTC研究結(jié)果顯示，大黃素對(duì)MRSA41577具有顯著的抑制作用，其最小抑菌濃度為8 μg/mL。

細(xì)胞膜是保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞正常的代謝的屏障結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的破壞，會(huì)影響菌體的生命活動(dòng)[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，大黃素對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，其抑菌作用機(jī)制主要是通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，抑制菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，抑制代謝關(guān)鍵酶的活性[12]。為探究大黃素對(duì)MRSA 41577細(xì)胞膜的影響，測(cè)定了經(jīng)大黃素作用后培養(yǎng)液中大分子和電導(dǎo)率的變化，研究結(jié)果顯示，8 μg/mL的大黃素作用菌體6 h后，電導(dǎo)率和大分子與對(duì)照組相比分別增加了(71.48±0.026)%和(2.39±0.102)%。說(shuō)明大黃素可破壞MRSA的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體內(nèi)無(wú)機(jī)離子和大分子外流，影響菌體正常的生理活動(dòng)。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)得以有效進(jìn)行的重要保證，蛋白質(zhì)合成受阻，會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理機(jī)能。本研究結(jié)果顯示，大黃素能顯著抑制MRSA41577的蛋白合成，其中8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，與對(duì)照組相比，蛋白總量下降了32.8%。蛋白質(zhì)的合成往往受核酸的調(diào)控，為進(jìn)一步探究大黃素對(duì)MRSA 41577核酸合成的影響，本研究測(cè)定了大黃素對(duì)MRSA核酸合成的影響，DAPI染色結(jié)果顯示，大黃素能抑制MRSA核酸的合成，其中8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，DNA和RNA含量分別降低了(4.82±1.06)%和(6.67±0.36)%。核苷酸是核酸發(fā)生改變的最低突變單位，組成核苷酸的磷酸基團(tuán)和堿基是藥物分子識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)[13]。一般情況下，藥物與DNA的相互作用方式比較復(fù)雜，包括靜電作用，氫鍵結(jié)合，范德華力，離子鍵和疏水作用等，且這幾種作用可以同時(shí)存在并相互誘導(dǎo)和強(qiáng)化[14]。其中，化合物的紫外吸收光譜峰如果出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象和減色效應(yīng)，表明該化合物與DNA發(fā)生了嵌入結(jié)合，反之則表明該化合物與DNA發(fā)生的是靜電作用或溝槽作用。如果化合物的紫外吸收峰出現(xiàn)增色效應(yīng)，表明化合物與DNA發(fā)生的是氫鍵結(jié)合[15-17]。本研究的紫外吸收光譜結(jié)果顯示，隨著質(zhì)粒DNA濃度的增加，大黃素的紫外吸收值逐漸增加，出現(xiàn)了增色效應(yīng)。說(shuō)明大黃素能通過(guò)和DNA之間發(fā)生氫鍵結(jié)合，影響DNA進(jìn)行正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，降低核酸的含量。

綜上所述，大黃素對(duì)MRSA的抑制作用機(jī)制主要是通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性，與DNA發(fā)生氫鍵結(jié)合，干擾核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成，致使菌體喪失其生物學(xué)功能。

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(編校：吳茜，譚玲)

Antibacterial mechanism of emodin on methicillin staphyloccocusn aureus

BI Yue, SUI Jia-qi, QIAO Rui-hong, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate effect of emodin on cell membrane, protein and nucleic acid synthesis of MRSA41577, and systematically investigate the anti-bacterial mechanism of emodin.MethodsTTC assay was used to detected the anti-bacterial activity of emodin on MRSA 41577.Conductivity and macromolecular were detected to investigate the effect of emodin on MRSA41577 cell membrane .SDS-PAGE was used to detect the effect of emodin on the soluble protein synthesis.DAPI staining was used to detect the effect of emodin on nucleic acid synthesis.UV-visible spectrophotometric was used to detected the interaction between emodin and DNA.ResultsEmodin has significant inhibitory activity on MRSA41577, and the minimum inhibitory concentration was 8 μg/mL.After treated with 8 μg/mL emodin for 6h, compared with control group, the macromolecular and conductivity improved (71.48±0.026)% (P<0.01) and (2.39±0.102)%(P<0.05), sepreatly.Compared with control, after treated with 8 μg/ml emodin for 16h，the protein reduced 32.8%, and the contents of DNA and RNA reduced (4.82 ±1.06)%(P<0.05,) and (6.67±0.36)%(P<0.053).The UV-visible spectrophotometric results indicated that emodin could integrate with DNA through hydrogen bond.ConclusionThe anti-bacterial mechanism of emodin mainly through damage the cell membrane, inhibit the replication and transcription of DNA through hydrogen bond, inhibit the synthesis of protein, and thus inhibit the biological function of bacteria.

emodin; MRSA; anti-bacterial; mechanism

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(No.L2013412);大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013E13SF108)

畢月，女，學(xué)士在讀，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：1027510122@qq.com；謝明杰，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com

R285.5

A

1005-1678(2015)08-0027-04