周長(zhǎng)凱，高靜，史士強(qiáng)，郝麗萍，荊凡波Δ

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266041)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

周長(zhǎng)凱1，高靜2，史士強(qiáng)1，郝麗萍1，荊凡波1Δ

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266041)

目的 建立脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量檢測(cè)方法。方法 采用高效液相色譜法對(duì)脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：色譜柱為SunfireTMC18柱(4.6 mm×15 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.03%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果 哈巴苷在0.1424～0.8544 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998)，平均回收率98.22%，RSD=1.46%(n=6)，哈巴俄苷在0.0732～0.4392 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997)，平均回收率99.27%，RSD=1.42%(n=6)。結(jié)論 該法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，可作為脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量測(cè)定方法。

脈絡(luò)寧注射液；哈巴苷；哈巴俄苷；含量測(cè)定；高效液相色譜法

脈絡(luò)寧注射液由金銀花、玄參、牛膝、石斛組成，具有清熱養(yǎng)陰、活血化瘀的功效，用于治療血栓閉塞性脈管炎、靜脈血栓形成、動(dòng)脈硬化性閉寒癥、腦血栓形成及其后遺癥等[1]。其作用機(jī)制與抗凝、溶栓、解痙、止痛、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)以及抗自由基等有關(guān)。脈絡(luò)寧注射液已有20余年的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，有較高的市場(chǎng)占有率，在防治各種急、慢性心腦血管等疾病中具有起效快、療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[2]。

組方藥材玄參系玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效。主治身熱煩渴、咽喉腫痛、瘰疬痰核、癰疽瘡毒等癥。玄參中含有多種環(huán)烯醚萜苷類成分，其中哈巴苷和哈巴俄苷含量最高。藥理研究發(fā)現(xiàn)哈巴苷和哈巴俄苷具有較強(qiáng)的抗炎、神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)免疫等作用，為玄參的特征性有效成分[3]。2010年版《中國(guó)藥典》以哈巴苷和哈巴俄苷的含量作為玄參藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[4]。目前未見脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量測(cè)定的報(bào)道，本文旨在采用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 3批脈絡(luò)寧注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20150109、20150110、20150111)；哈巴苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111729-200907)；哈巴俄苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111730-200903)；乙腈(美國(guó)Fisher公司，色譜純)；娃哈哈純凈水；其他為分析純(北京高華偉業(yè)化學(xué)品有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器 Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵系統(tǒng)，2998型PDA檢測(cè)器，柱溫控制系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Sartorius BP211D電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：SunfireTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.03%磷酸水溶液溶梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.2 對(duì)照品溶液制備：分別精密稱取哈巴苷對(duì)照品7.12 mg、哈巴俄苷對(duì)照品3.66 mg于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含哈巴苷0.712 mg、哈巴俄苷0.366 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL分別含哈巴苷0.0712 mg、哈巴俄苷0.0366 mg的混合溶液，精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣，測(cè)定。

1.3.3 供試品溶液制備：精密量取脈絡(luò)寧注射液2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.4 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性：依上述色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL、供試品溶液20 μL，分別進(jìn)樣。

1.3.5 線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液(每1 mL分別含哈巴苷0.071 μg、哈巴俄苷0.0366 μg)各2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。

1.3.6 精密度考察 取脈絡(luò)寧注射液供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。

1.3.7 重復(fù)性考察：取同一批樣品6份，按“1.3.3 供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積，計(jì)算含量。

1.3.8 穩(wěn)定性考察：取脈絡(luò)寧注射液供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣每次20 μL，測(cè)定哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積。

1.3.9 回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的脈絡(luò)寧注射液1 mL(含哈巴苷3.175 g/L，哈巴俄苷0.4182 g/L)6份，置100 mL容量瓶中，分別精密添加一定量的對(duì)照品溶液，按“1.3.3供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算哈巴苷和哈巴俄苷的加樣回收率。

1.4 樣品含量測(cè)定：分別取3批脈絡(luò)寧注射液，按“1.3.3 供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品，按“1.3.1 色譜條件”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算哈巴苷、哈巴俄苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 在對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，見圖1。圖1表明建立的色譜條件能將哈巴苷、哈巴俄苷很好地分離。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.脈絡(luò)寧注射液；1.哈巴俄苷；2.哈巴苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.Reference substance;B.Mailuoning injection; 1.Harpagoside;2.Harpagide

2.2 線性關(guān)系考察 以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，哈巴苷回歸方程分別為：Y=2854.7X-12.133，r=0.9998。哈巴俄苷回歸方程為Y=1815.4X+324.73，r=0.9997。結(jié)果表明哈巴苷進(jìn)樣量0.1424～0.8544 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，哈巴俄苷進(jìn)樣量在0.0732～0.4392 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度考察 哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積RSD分別為0.72%，1.29%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察 哈巴苷的平均含量為3.175 g/L(RSD=2.31%)；哈巴俄苷的平均含量為0.4182 g/L(RSD=1.97%)。結(jié)果表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察 計(jì)算RSD分別為2.01%，1.82%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn) 哈巴苷和哈巴俄苷的加樣。平均回收率分別為98.22%，99.27%。見表2、表3。

表2 脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 The recovery experiment results of harpagide in Mailuoning injection(n=6)

表3 脈絡(luò)寧注射液中哈巴俄苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 The recovery experiment results of harpagoside in Mailuoning injection(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定 樣品含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 3批脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷、哈巴俄苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Fig.4 Determination results of harpagide and harpagoside in 3 batches of Mailuoning injection(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)曾采用乙腈-0.03%磷酸水溶液等度洗脫，但注射液中成分復(fù)雜，所得色譜峰峰形差，特征峰難以區(qū)分，經(jīng)不斷摸索最終選定文中梯度洗脫條件，并進(jìn)行了相應(yīng)方法學(xué)考察。脈絡(luò)寧注射液是由金銀花、玄參、牛膝等中藥精制提取而成的一種復(fù)方制劑[6]。金銀花性寒、味甘、氣芳香，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱之功效。玄參味甘、苦、咸；性微寒；歸肺，胃，腎經(jīng)；玄參，稟至陰之性，專主熱病，味苦則泄降下行，故能治臟腑熱結(jié)等證。牛膝性味苦甘酸平，具有活血通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，利尿通淋，引血(火)下行之功效。石斛，性味甘；微寒。歸胃、肺、腎經(jīng)。治療熱病傷津；口干煩渴；胃陰不足；胃痛干嘔；肺燥干咳；虛熱不退；陰傷目暗；腰膝軟弱。整個(gè)方劑合用具有養(yǎng)陰清熱、補(bǔ)益肝腎、活血化瘀的功效，臨床應(yīng)用廣泛[7]。目前其質(zhì)量控制方法的研究多集中在酚酸類成分含量測(cè)定[8-10]，其他功效成分的測(cè)定卻鮮見報(bào)道。環(huán)烯醚萜苷類是玄參中的主要藥效成分，其含量對(duì)脈絡(luò)寧注射液的質(zhì)量具有重要影響。本文建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定脈絡(luò)寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量測(cè)定方法，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，為脈絡(luò)寧注射液的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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[2] 龐曉斌，謝欣梅，王海燕，等.脈絡(luò)寧對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(4)：721-725.

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(編校：王冬梅)

Simultaneous determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC

ZHOU Chang-kai1, GAO Jing2, SHI Shi-qiang1, HAO Li-ping1, JING Fan-bo1Δ

(1.Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Qingdao, Qingdao 266041, China)

ObjectiveTo establish a method for content determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC.MethodsThe experimental condition of HPLC method was as follows: SunfireTMC18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), with gradient elution using acetonitrile and 0.03% phosphoric acid; the detected wavelength was 210 nm, and the flow rate was 1.0mL/min.ResultsHarpagide and harpagoside demonstrated good linear relationship in the range 0.1424～0.8544 μg/mL(r=0.9998) and 0.0732～0.4392 μg/mL (r=0.9997) respectively.The average recovery rate were 98.22% and 99.27% with RSD of 1.46% and 1.42%(n=6)respectively.ConclusionThe method is simple, reliable, accurate, reproducible and stable, and it could be used in the determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection.

Mailuoning injection; harpagide; harpagoside; content determination; HPLC

周長(zhǎng)凱，男，碩士，藥師，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)、臨床藥學(xué)，E-mail：165643396@qq.com；荊凡波，通訊作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)，E-mail：jingbf178@sina.com。

R286.0

A

1005-1678(2015)08-0173-03