何毓琦，汪曉峰

（北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國家工程實驗室，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

種子老化是指種子成熟后，活力逐漸下降的不可逆過程。這種自然現(xiàn)象一直是種質(zhì)保存面臨的一個嚴(yán)重問題。雖然低溫保存是種子貯存相對理想的途徑，但隨著貯藏時間的延長，劣變?nèi)詴l(fā)生［1］。前人在種子老化機理方面已做了大量的研究工作，主要集中于種子抗氧化體系、膜質(zhì)過氧化和染色體畸變 等 方 面［2－4］。但 仍 有 許 多 問 題 尚 不 清 楚。El－Maarouf－Bouteau等［5］在向日葵種子老化過程中發(fā)現(xiàn)了DNA 改變和細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的發(fā)生，本實驗室前期工作表明家榆種子老化過程中不僅發(fā)現(xiàn)了PCD 的發(fā)生，同時還發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）積累與PCD 的發(fā)生具有相關(guān)性［6］。至此，種子老化已進(jìn)入細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)等深層次研究階段。

一氧化氮（NO）是一種重要的氣體自由基分子，化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，極易通過細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，是動植物細(xì)胞中的一種重要的信號分子［7］。研究表明，NO 參與植物生長發(fā)育的諸多生理過程，如光形態(tài)建成、葉片和根的生長、氣孔運動等；在合適的濃度下可作為一種抗脅迫分子，阻止成熟和衰老的發(fā)生，且對植物PCD 有調(diào)控作用［8－11］。NO 在植物體內(nèi)的產(chǎn)生途徑主要有硝酸鹽－亞硝酸鹽依賴型途徑（包括胞質(zhì)硝酸還原酶途徑和根特異性亞硝酸鹽－NO 還原酶途徑等）和L－精氨酸（L－Arg）依賴型途徑（類一氧 化 氮 合 酶 途 徑）［12－13］。研 究 表 明NO 在 植 物 體 內(nèi)的作用方式有多種，如蛋白質(zhì)亞硝基化、與Ca2＋和H2O2等多種信號分子相互作用，以及多種抗氧化酶體系的調(diào)控等［14－16］。目前在種子上對NO 的研究主要集中于打破種子休眠和調(diào)控種子萌發(fā)等方面［17］，其是否參與調(diào)控種子老化后活力的喪失，目前尚無報道。

家榆（Ulmus pumila L．）為北方常見樹種，抗逆性較強；種子不易貯存，發(fā)芽迅速、整齊，個體差異較小，可視為林木種子老化研究的模式樹種。本研究以家榆種子為試材，采用種子活力檢測技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、蛋白質(zhì)S－亞硝基化檢測技術(shù)等，結(jié)合多種相關(guān)抑制劑的使用，從種子生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等角度闡述NO 對家榆種子老化的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1．1 實驗材料與試劑

實驗用家榆種子于2013年4月底采摘于北京林業(yè)大學(xué)校園。初始發(fā)芽率為98．0%，初始含水量為7．05%，采后密閉貯藏于－20℃冰柜待用。實驗主要試劑有NO 供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）、類 一 氧 化 氮 合 酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制劑L－NAME（Nw－nitro－L－arginine methyl ester hydrochloride）、一氧化氮清除劑cPTIO［2－（4－carboxyphenyl）－4，4，5，5－tetramethyl－imidazoline－1－1－oxyl－3－oxide］、硝酸還原酶抑制劑Na2WO4·2H2O、類一氧化氮合酶底物L(fēng)－Arg、硝酸還原酶底物NaNO2。SNP、L－NAME、cPTIO 均購于Sigma公司，其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

1．2 處理方法

1．2．1 藥劑預(yù)處理 （1）SNP 處理 參考Bethke等［18］方法進(jìn)行。如圖1所示，在1個10cm 培養(yǎng)皿中，放入2個敞開的裝有種子的3．5cm 培養(yǎng)皿作為接收皿，1個敞開的裝有SNP溶液的3．5cm 培養(yǎng)皿作為供體皿。將10cm 培養(yǎng)皿用封口膜封好，放入光照培養(yǎng)箱中（溫度25℃、光強為80μmol·m－2·s－1）培養(yǎng)12h。處理分兩類：一類是分別用0、50、75、100、150、200μmol·L－1SNP 進(jìn)行梯度濃度處理，考察種子萌發(fā)隨SNP濃度變化特征，篩選出家榆種子預(yù)處理的最佳濃度；另一類是采用最佳濃度（100 μmol·L－1）SNP 與抑制劑進(jìn)行共處理。然后將處理后種子于室溫中晾干，隨后進(jìn)行老化處理。

圖1 SNP蒸氣處理方法示意圖Fig．1 An illustration of the experimental system used to apply vapours from SNP

（2）底物和抑制劑處理 實驗所用抑制劑為50 μmol·L－1Na2WO4·2H2O、50μmol·L－1cPTIO、100μmol·L－1L－NAME；硝酸還原酶底物NaNO2的濃度分別為0、200、500、1 000和10 000 μmol·L－1，一氧化氮合成酶的底物L(fēng)－Arg的濃度分別為0、50、100、200、500和1 000μmol·L－1。配制上述處理溶液后，將家榆種子分別置于溶液中，4℃浸種10h后取出，平鋪于濾紙上，室溫晾干至原始含水量。隨后進(jìn)行老化處理。

（3）SNP與抑制劑共處理 先將種子按上述抑制劑處理方法處理10h，晾干后再用SNP蒸氣處理12h。晾干后進(jìn)行老化處理。

1．2．2 人工控制老化處理 按本實驗室前期建立的種子老化體系，將預(yù)處理及對照（未做藥劑處理）種子置于37 ℃、100%相對濕度（RH）條件下進(jìn)行老化處理。（1）將對照種子進(jìn)行老化環(huán)境下平衡（post equilibrate，PE）24h（種子達(dá)到穩(wěn)定含水量的時間）以及分別老化處理1、2、3、4、5d，考察種子發(fā)芽率和種子活力隨老化時間的變化特征，選擇后續(xù)實驗種子的適宜老化處理時間。（2）將各類藥劑預(yù)處理的種子進(jìn)行老化處理3d，在室溫下晾干至原始含水量后測定后續(xù)指標(biāo)。

1．3 測定指標(biāo)與方法

1．3．1 發(fā)芽率及活力指數(shù) 發(fā)芽床為9cm 培養(yǎng)皿加雙層濾紙，用蒸餾水潤濕，每皿放50粒老化處理種子，4次重復(fù)。發(fā)芽在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為25 ℃，光強為80μmol·m－2·s－1，光暗時間各為12h。記錄每天的發(fā)芽數(shù)及7d后全苗重。7d后總發(fā)芽數(shù)占種子總數(shù)百分率即為發(fā)芽率（germination rate，Gr），活力指數(shù)（VI）按按下式計算：

VI＝G1×Sx

式中，G1為在時間t的發(fā)芽率，等于每天發(fā)芽種子數(shù)（Gt）同其相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)（Dt）之比的總和；Sx為發(fā)芽7d后全苗重［3］。

1．3．2 DAF－FM DA 原位熒光標(biāo)記檢測 利用震蕩切片機在pH 7．4PBS緩沖液中將平衡24h及老化0（CK）、1、2、3、4、5d的種子切成50μm 的切片，然后于含10μmol·L－1DAF－FM DA 的PBS中避光染色40 min，再用PBS 漂洗2 次，然后壓片、封片。用激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長515nm）鏡檢。

1．3．3 蛋白質(zhì)S－亞硝基化檢測 采用Biotin Switch法進(jìn)行蛋白質(zhì)S－亞硝基化檢測。分別用液氮研磨老化0（CK）、2、3和5d的種子20粒，用700μL HEN Buffer（250mmol·LHepes pH 7．7，1mmol·L－1EDTA，0．1 mmol·L－1Neocuproine）溶解 粉末，用Blocking Buffer（250 mmol·L－1Hepes pH 7．7，1mmol·L－1EDTA，0．1mmol·L－1Neocuproine，2．5%SDS，20mmol·L－1MMTS）重懸蛋白，50 ℃孵育30 min，每4 min振蕩1 次。加入2倍體積預(yù)冷的丙酮，－20 ℃孵育1h，4 ℃、3 000g離心10min，棄上清。用HEN Buffer（250mmol·L－1Hepes pH 7．7，1mmol·L－1EDTA，0．1mmol·L－1Neocuproine，1%SDS）重懸蛋白，加入4mmol·L－1biotin－HPDP（用DMF 配制）和1 mmol·L－1抗壞血酸，室溫孵育1h，每10min振蕩1次。以不加biotin－HPDP和抗壞血酸的無生物素標(biāo)記的CK蛋白組為陰性對照組，用以檢測種子內(nèi)源生物素蛋白。

生物素標(biāo)記后進(jìn)行Western blotting實驗。將蛋白定量為統(tǒng)一濃度后，經(jīng)10%SDS－PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜置于封閉液（含2% BSA的PBS緩沖液）中振蕩1h，然后于含HRP的封閉液中雜交過夜（抗體稀釋比例1∶3 000）。洗滌液（含0．5% Tween－20的PBS緩沖液）漂洗5 次，每次10min。將顯色液A 和顯色液B按1∶1比例混合后加到膜上反應(yīng)5 min，鋪上保鮮膜后置于壓片夾中，暗室中顯影、定影。

2 結(jié)果與分析

2．1 人工老化過程中家榆種子活力的變化特征

圖2 人工控制老化家榆種子發(fā)芽率和活力指數(shù)PE．種子老化平衡期Fig．2 Germination rate and vigor index of elm seeds during artificial ageing PE．Post equilibrate

家榆種子為典型雙子葉無胚乳種子，初始發(fā)芽率為98．0%。圖2顯示，種子在37 ℃、1 0 0%相對濕度條件下平衡24h后，發(fā)芽率小幅降至96．0%；老化2d后種子發(fā)芽率降至80．0%，活力指數(shù)下降了約50%；老化3d后發(fā)芽率急劇降至50．0%，種子活力降至0．5；老化4～5d后種子發(fā)芽率約2．0%，活力很低。綜合上述結(jié)果，本研究選擇未老化（對照）和老化3d（種子活力下降50%）的種子進(jìn)行后續(xù)的藥物學(xué)處理實驗。

2．2 外源NO 供體SNP與NO 清除劑處理對家榆種子活力的影響

為研究NO 在家榆種子老化中所起作用，實驗使用外源NO 供體SNP對家榆種子進(jìn)行預(yù)處理，老化后檢測種子活力的變化。結(jié)果表明，家榆種子發(fā)芽率和活力指數(shù)隨SNP 濃度的升高而增高，當(dāng)SNP濃度達(dá)到100μmol·L－1時，發(fā)芽率和活力指數(shù)均達(dá)到最高，此時發(fā)芽率達(dá)71．0%，與對照差異極顯著；其后隨SNP 濃度的繼續(xù)增高，兩項指標(biāo)均呈下降趨勢，當(dāng)SNP 濃度達(dá)到200μmol·L－1時，發(fā)芽率降低至42．0%，已產(chǎn)生顯著抑制作用（圖3，A），表明100μmol·L－1SNP為家榆種子預(yù)處理的最佳濃度。另外，家榆種子單獨用NO 清除劑cPTIO 處理后，再老化后的發(fā)芽率降至33．0%，而用抑制劑處理后再用SNP蒸氣處理，老化種子發(fā)芽率回升為47．5%（圖3，D）。說明外源NO 可顯著提高種子抗老化能力；NO 清除劑cPTIO 可顯著降低種子抗老化能力，而外源NO 可恢復(fù)cPTIO 產(chǎn)生的抑制效果，表明NO 可提高種子抗老化能力。

2．3 一氧化氮合酶、硝酸還原酶活性與家榆種子老化的關(guān)系

為研究NO 在家榆種子老化中的產(chǎn)生途徑，實驗使用硝酸還原酶底物亞硝酸鈉、硝酸還原酶抑制劑鎢酸鈉、一氧化氮合酶底物L(fēng)－Arg、一氧化氮合酶抑制劑L－NAME 進(jìn)行預(yù)處理，老化后檢測種子活力的變化。結(jié)果表明，老化后種子活力隨亞硝酸鈉濃度的升高而逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到500μmol·L－1時，發(fā)芽率達(dá)到最高值（64．0%），與對照差異達(dá)到極顯著水平，其后隨亞硝酸鈉濃度的升高而下降；當(dāng)濃度升高到1 000μmol·L－1時，亞硝酸鈉對種子萌發(fā)開始產(chǎn)生抑制，當(dāng)濃度升高至10 000μmol·L－1時發(fā)芽率降低至0．7%；同時，在亞硝酸鈉處理前預(yù)先用硝酸還原酶抑制劑鎢酸鈉共處理，可顯著減弱亞硝酸鈉引起的老化后種子活力提升，發(fā)芽率降低為43．3%（圖3，B）。隨著L－Arg濃度的增加，家榆種子老化后種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；當(dāng)濃度為200μmol·L－1時種子發(fā)芽率達(dá)到最高（70．5%），隨后，當(dāng)濃度達(dá)到1mmol·L－1時，LArg 對種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著抑制，發(fā)芽率降低至27．0%（圖3，C）。用類一氧化氮合酶（NOS）抑制劑L－NAME、硝酸還原酶抑制劑鎢酸鈉處理后，種子老化后的發(fā)芽率分別降低至40．5%、27．5%；而用2種抑制劑處理后再用SNP蒸氣處理，發(fā)芽率分別回升為68．0%、43．0%（圖3，D）。

圖3 多種藥劑處理對家榆種子老化后種子活力的影響Fig．3 Effects of pharmaceutical treatment on seed vigor in elm seeds under controlled ageing T．50μmol·L－1 Na2WO4＋500μmol·L－1 NaNO2；CK．H2O＋H2O；Ⅰ．H2O＋SNP；Ⅱ．cPTIO＋H2O；Ⅲ．cPTIO＋SNP；Ⅳ．Na2WO4＋H2O；Ⅴ．Na2WO4＋SNP；Ⅵ．L－NAME＋H2O；Ⅶ．L－NAME＋SNP

圖4 DAF法檢測不同老化處理家榆種子中NO 的含量Fig．4 DAF assay of content of NO in different parts of elm seeds during ageing

可見，一氧化氮合酶和硝酸還原酶的底物在一定濃度范圍內(nèi)均可提高家榆種子老化后的活力水平，兩種酶的抑制劑均可顯著降低種子老化后的活力，且抑制劑產(chǎn)生的抑制效果可被SNP 所恢復(fù)，說明硝酸還原酶與類一氧化氮合酶可參與家榆種子老化中NO 的產(chǎn)生。

2．4 家榆種子老化過程中細(xì)胞內(nèi)NO 含量與蛋白質(zhì)S－亞硝基化水平的變化

采用NO 特異性熒光染料DAF－FM DA 進(jìn)行NO 熒光標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡觀察家榆種子老化過程中內(nèi)源NO 的變化。如圖4所示，老化處理后的家榆種子子葉中NO 含量先升高后降低，在種子老化平衡期達(dá)到最高值，而在發(fā)芽率為80．0%時次之；而胚根尖部NO 的含量逐漸升高，到發(fā)芽率為0時達(dá)到最高；生長點與下胚軸則在發(fā)芽率為2．0%時才有NO 出現(xiàn)。即種子老化過程中NO 水平發(fā)生了時空特異性變化，說明NO 與種子老化中活力的喪失具有不可忽視的聯(lián)系。

圖5 Biotin swtich法檢測不同老化處理家榆種子中S－亞硝基化水平－．內(nèi)源生物素；0d、2d、3d、5d．老化不同天數(shù)種子S－亞硝基化蛋白；←．S－亞硝基化水平上升條帶Fig．5 Biotin switch assay of S－nitrosylation level in elm seeds during ageing－．Endogenous biotin；0d，2d，3d，5d．S－nitrosylation protein of seeds ageing different time；←．The strips of S－nitrosyaltion level rise

家榆種子內(nèi)源生物素蛋白［條帶（－）］及發(fā)芽率80．0%（老化2d）、50．0%（老化3d）、2．0%（老化5 d）后種子中蛋白的S－亞硝基化情況如圖5 所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生物素化蛋白含量很低，基本可以忽略不計；S－亞硝基化水平在發(fā)芽率80．0%時顯著升高，隨后在發(fā)芽率50．0%時略有降低，發(fā)芽率為2．0%時部分條帶略有上升（圖中標(biāo)記條帶），但總體水平均高于未老化種子（CK）。這與圖4中種子中NO 產(chǎn)生的時間特點相一致，說明種子體內(nèi)蛋白質(zhì)S－亞硝基化水平與其NO 的產(chǎn)生相關(guān)。

3 討 論

NO 可調(diào)控植物的成熟和衰老。目前，已有較多的證據(jù)表明NO 和它的衍生物N2O 通過延緩組織衰老進(jìn)程、抑制乙烯合成來提高果蔬貯藏過程中抵御逆境的能力，并改善果蔬采后貯藏的品質(zhì)［19］。通過利用NO 清除劑（PTIO）清除積累的NO，水稻葉片細(xì)胞死亡都得到明顯減輕，表明NO 介導(dǎo)了H2O2誘導(dǎo)的葉片細(xì)胞死亡［20］。本研究通過NO 供體和抑制劑綜合處理，發(fā)現(xiàn)外源NO 處理可延緩家榆種子死亡，提高種子抗老化能力。

NO 在動物體內(nèi)合成主要通過L－Arg依賴型途徑，即通過一氧化氮合酶（NOS）將L－Arg轉(zhuǎn)變?yōu)長cit，進(jìn)而產(chǎn)生NO。自從Corpas等在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種L－Arg依賴型NO 合成途徑后，NOS在植物界中的研究得到了廣泛的關(guān)注［21］。目前，人們已發(fā)現(xiàn)NOS在鹽脅迫、葉片衰老以及種子萌發(fā)等方面均可參與NO 的生成［22－24］。此外，Bright等［25］在 研究ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉與NO 之間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體nia1、nia2對ABA 的反應(yīng)異常，即ABA 不能引起2種突變體中NO 的產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉，說明硝酸還原酶與ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉中NO的產(chǎn)生密不可分。隨后，Zhao等［26］在擬南芥葉片冰凍脅迫時也發(fā)現(xiàn)了硝酸還原酶產(chǎn)生NO。此后，硝酸還原酶依賴型NO 合成途徑逐漸得到人們的重視。2011年，Bai等［27］在干旱脅迫下的種子胚軸中發(fā)現(xiàn)了NO 的產(chǎn)生，并且此NO 的產(chǎn)生可被類NOS酶抑制劑L－NAME和硝酸還原酶抑制劑鎢酸鈉所抑制，說明類NOS酶和硝酸還原酶與干旱脅迫下NO 的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究通過NO 相關(guān)藥劑學(xué)處理，發(fā)現(xiàn)硝酸還原酶底物亞硝酸鈉、類一氧化氮合酶底物L(fēng)－Arg可提升種子活力，硝酸還原酶抑制劑鎢酸鈉、類一氧化氮合酶抑制劑L－NAME 可降低種子活力，且兩種抑制劑的作用可被NO 供體SNP所恢復(fù)，說明硝酸還原酶途徑和類一氧化氮合酶途徑可參與種子老化中NO 的合成。

NO 在植物體內(nèi)的作用方式有多種，研究比較多的主要包括其與多種信號分子如Ca2＋、H2O2的相互作用，蛋白質(zhì)亞硝基化以及其與多種抗氧化酶之間的關(guān)系等。其中，蛋白質(zhì)S－亞硝基化由于其作用范圍廣而備受人們關(guān)注。自從Lindermayr等［28］于2005年在NO 孵育后的擬南芥葉片和懸浮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)S－亞硝基化蛋白后，S－亞硝基化在植物中的研究逐漸深入。目前，已發(fā)現(xiàn)S－亞硝基化蛋白可參與許多細(xì)胞響應(yīng)，如物質(zhì)代謝、光合作用、氧化還原反應(yīng)、免疫反應(yīng)與應(yīng)激反應(yīng)等。2011 年，Bai等［27］發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下種子內(nèi)的S－亞硝基化水平顯著降低，同時抗氧化酶活性降低，種子活力減弱，說明S－亞硝基化可影響頑拗性種子的脫水耐性，至此S－亞硝基化在種子中的研究開始起步。本研究通過DAF－FM DA 熒光染色，在老化的家榆種子中發(fā)現(xiàn)了NO 的產(chǎn)生，種子在平衡過程（PE）和發(fā)芽率80．0%時，其子葉中NO 含量最高，而在發(fā)芽率為0時生長點與下胚軸才有NO 出現(xiàn)。通過Biotin switch結(jié)合Western blotting法，對不同老化處理家榆種子進(jìn)行S－亞硝基化檢測，發(fā)現(xiàn)S－亞硝基化水平與NO 在種子中產(chǎn)生的時間特點一致，說明體內(nèi)蛋白質(zhì)S－亞硝基化水平與NO 的產(chǎn)生相關(guān)。

綜上所述，NO 在種子老化中具有不可忽視的作用。外源NO 供體可提升種子活力，NO 清除劑cPTIO 可降低種子活力，外源NO 供體可恢復(fù)NO清除劑的抑制效果，證明NO 可提高種子抗老化能力。硝酸還原酶和一氧化氮合酶底物在一定濃度范圍內(nèi)均可提高種子老化后的活力水平，2種酶的抑制劑均可顯著降低種子老化后的活力，且抑制劑產(chǎn)生的抑制效果可被SNP所恢復(fù)，說明硝酸還原酶與類一氧化氮合酶可能參與種子老化中NO 的產(chǎn)生。種子老化過程中出現(xiàn)了蛋白質(zhì)S－亞硝基化，且S－亞硝基化水平與NO 產(chǎn)生的時間特點一致，顯示S－亞硝基化水平與NO 的產(chǎn)生有關(guān)。據(jù)此可以認(rèn)為，NO可提高種子抗老化能力，其在種子內(nèi)可通過硝酸還原酶途徑和類一氧化氮合酶途徑產(chǎn)生，且種子蛋白質(zhì)S－亞硝基化水平與NO 的產(chǎn)生相關(guān)。

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