孫 昂，粟玉萍，代 敏，蘇湘暉，胡 濱

（岳陽市中心血站，湖南414000）

HLA新等位基因HLA-DRB1*09：19的確認(rèn)及序列分析

孫 昂，粟玉萍，代 敏，蘇湘暉，胡 濱

（岳陽市中心血站，湖南414000）

目的應(yīng)用DNA測序方法確認(rèn)人類白細(xì)胞抗原（HLA）-DRB1新等位基因。方法應(yīng)用基因測序技術(shù)對造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者進(jìn)行HLA分型，發(fā)現(xiàn)1個與HLA-DRB1*09相關(guān)的異常等位基因，采用Sanger法對其第2外顯子進(jìn)行測序分析，以確認(rèn)是否為新的基因序列。結(jié)果1例樣本DRB1*09：XX第2外顯子序列與所有已知等位基因序列均不一致，與DRB1*09：01：02高度相似，外顯子2區(qū)域中的149位堿基發(fā)生了C→T堿基替代，并導(dǎo)致了相應(yīng)氨基酸序列蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷＝Y(jié)論該等位基因為HLA-DRB1*09組中的1個新等位基因，被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為DRB1*09：19。

HLA-DR抗原/遺傳學(xué)；HLA抗原；等位基因；核酸探針；序列分析

自 1958年發(fā)現(xiàn)第 1個人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），人類開始了對HLA的研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，對HLA的研究逐步深入[1]。中華骨髓庫岳陽HLA分型實驗室在對造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者進(jìn)行HLA分型時，發(fā)現(xiàn)1例HLA-DRB1新等位基因，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者，湖北籍，漢族，男，2013年12月在岳陽市捐獻(xiàn)血液時同意捐獻(xiàn)造血干細(xì)胞，2014年5月在本實驗室HLA分型中因與軟件數(shù)據(jù)庫中所有已知HLA-DRB1位點等位基因核苷酸序列不一致而進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本DNA提取 抽取志愿者外周靜脈血（EDTA抗凝）5 mL，采用DNA提取純化試劑（北京TIANGEN公司，批號∶L0116），按試劑說明書提取DNA，擴(kuò)增前調(diào)整DNA濃度40～100 ng/μL，光密度（OD）260/280∶1.6～1.8。

1.2.2 標(biāo)本HLA基因分型 采用HLA SBT試劑盒（荷蘭GenDx公司，批號∶11250611）進(jìn)行HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點的常規(guī)高分辨基因分型，使用美國Onelambda公司HLA Fusion 3.0軟件分析HLA基因型。

1.2.3 新等位基因的確定 對不能確定的HLA-DRB1位點基因型的樣本采用位點特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶純化及稀釋后作為模板，根據(jù)Sanger法對其第2外顯子進(jìn)行測序分析，正向測序按照等位基因組間差異分成兩組，即2Fa和2Fb。2Fb組檢測DRB1* 04∶07∶09基因型，2Fa組則檢測除DRB1*04∶07∶09以外的其他基因型。測序方法∶用DRB1位點擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，序列組合9 μL，總體積10 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR程序為預(yù)變性96℃、10 s 1個循環(huán)，變性96℃、10 s，退火50℃、10 s，延伸60℃、120 s 25個循環(huán)，15℃保存。PCR產(chǎn)物純化后用3730 DNA分析儀（美國ABI公司）測定序列。所有操作嚴(yán)格按試劑和儀器說明書進(jìn)行。通過2次獨立PCR擴(kuò)增，分別測序，驗證結(jié)果的正確性，采用SBTengine軟件分析序列判讀基因序列，通過EBI（http∶//www.ebi.ac.uk）和NCBI（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行HLA等位基因序列比對（BLAST），以確認(rèn)是否為新的基因序列。

2 結(jié) 果

2.1 PCR-SBT分型結(jié)果 測序結(jié)果導(dǎo)入軟件后分析結(jié)果顯示，該志愿者HLA-DRB1位點與等位基因DRB1*08∶03∶02和DRB1*09∶01∶02有1個堿基不匹配，不能指定為任何HLA-DRB1位點等位基因。測序結(jié)果見圖1，DRB1*08∶03∶02、DRB1*09∶01∶02的序列在 149位堿基應(yīng)為C，而該標(biāo)本在此堿基位置為Y（C+T），提示存在突變。

圖1 HLA-DRB1*08：03：02、DRB1*09：01：02的雜合測序結(jié)果

2.2 新等位基因與DRB1*09∶01∶02序列差異分析根據(jù)正向2Fb引物測序結(jié)果顯示，未知基因與同源性最高的等位基因DRB1*09∶01∶02序列差異在第2外顯子，編碼序列在149位堿基發(fā)生了C→T的改變（圖2），導(dǎo)致密碼子第21位發(fā)生了ACG→ATG的改變，結(jié)果造成第50位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕et）（圖3）。該等位基因的測序結(jié)果擴(kuò)增涵蓋了第2、3外顯子，測序長度為270、282 bp，將這2個外顯子序列提交給Genbank，獲得Genbank登錄號JX040451。將新等位基因相關(guān)數(shù)據(jù)上報給WHO的HLA因子命名委員會，2014年12月22日被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為HLA-DRB1*09∶19。

圖2 DRB1*09：19與DRB1*09：01：02核苷酸序列比對

圖3 DRB1*09：19與DRB1*09：01：02氨基酸序列比對

3 討 論

HLA系統(tǒng)是目前已知人類最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性主要表現(xiàn)在同一基因座位的等位基因的高度多態(tài)性[2]；在單核苷酸多態(tài)性水平上，HLA區(qū)域的基因多態(tài)性（5%～17%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人類基因組多態(tài)性（0.08%～0.20%）[3]。HLA系統(tǒng)還具有明顯的種族特異性和地域差異性[4]，本實驗室測得岳陽漢族人群DRB1*09的基因頻率為19.41%，與湖北人群比較無顯著性差異，與北方人群比較有顯著性差異[5]。

隨著中華骨髓庫和世界骨髓庫的庫容量的擴(kuò)大，越來越多的HLA新等位基因被發(fā)現(xiàn)[6-7]。2011年全世界僅發(fā)現(xiàn)HLA等位基因6 403個[8]；而截止2015年1月31日，HLA等位基因已發(fā)現(xiàn)12 542個，各位點基因數(shù)都相應(yīng)增加（http∶//www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html）。岳陽HLA分型實驗室自2004年發(fā)現(xiàn)第1例新等位基因并被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為HLAB*54∶03以來[9]，截止2014年12月底，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)異?；?1例，已被WHO的HLA因子命名委員會證實命名新等位基因16例，另5例正在等待證實命名中。

HLA系統(tǒng)中的DR抗原是異基因移植免疫反應(yīng)中最重要的抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態(tài)性[10]。不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1位點與疾病的發(fā)生具有相關(guān)性，如HLA-DRB1*08為新疆漢族人群再生障礙性貧血的易感基因[11]，HLADRB1*12∶02與新生兒溶血病的發(fā)生呈正相關(guān)[12]等。HLA新等位基因的研究極大地豐富了人類遺傳學(xué)寶庫，隨著研究人員的不斷努力，將得到不同種族、不同地域人群的HLA基因型，而中國人特異的HLA新等位基因?qū)⒏嗟乇话l(fā)現(xiàn)，這對人類家系調(diào)查、法醫(yī)鑒定、器官移植特別是造血干細(xì)胞移植、疾病的防治將起到重要作用。

[1]Robinson J，Halliwell JA，McWilliam H，et al.The IMGT/HLA database[J]. Nucleic Acids Res，2013，41∶1222-1227.

[2]Marsh SG，Albert ED，Bodmer WF，et al.Nomenclature for factors of the HLA system，2004[J].Tissue Antigens，2005，65（4）∶301-369.

[3]王振雷，劉艷平，蘇蔓，等.HLA新等位基因HLA-A*33∶39的序列分析及鑒定[J].中國輸血雜志，2013，26（7）∶624-625.

[4]王振雷，何路軍，劉艷平，等.36380名河北漢族HLA供者基因多態(tài)性及其分布特征[J].中國輸血雜志，2008，21（3）∶169-171.

[5]孫昂.岳陽市漢族造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者HLA-DRB1高分辨基因多態(tài)性研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，18（6）∶1002-1005.

[6]孫玉英，奚永志.我國大陸人群HLA新等位基因發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)狀及應(yīng)注意的問題[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（32）∶2233-2235.

[7]Klitz W，Hedrick P，Louis E.Understanding the new allele problem[J]. Tissue Antigens，2011，77（5）∶370.

[8]蘇湘暉，孫昂，粟玉萍，等.岳陽地區(qū)漢族人群HLA-A、-B、-DRB1高分辨等位基因多態(tài)性研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19（9）∶1307-1310.

[9]粟玉萍，羅志紅，宋學(xué)輝，等.DNA序列分析鑒定HLA新等位基因B*5403[J].中華醫(yī)學(xué)臨床雜志，2006，4（5）∶17-19.

[10]龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].2版.北京∶科學(xué)出版社，2003∶118-121.

[11]王璠，胡安華，楊妍，等.新疆漢族HLA-DRB1基因多態(tài)性與再生障礙性貧血的相關(guān)性[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（2）∶188-190.

[12]孫昂，方奎明，粟玉萍，等.新生兒溶血病與HLA-DRB1相關(guān)性研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21（6）∶649-651.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.13.032

：B

：1009-5519（2015）13-2009-02

∶2015-02-17）

∶孫昂（1972-），男，湖南岳陽人，碩士研究生，副主任技師，主要從事HLA分型、親子鑒定、疑難血型鑒定等工作；E-mail∶sunang1992@163.com。

∶蘇湘暉（E-mail∶921998392@qq.com）。