李惠霞，劉永剛，張俊蓮，王 蒂＊

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，蘭州730070；2 甘肅省作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730070；3 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州730070）

馬鈴薯晚疫病又稱馬鈴薯瘟，是由致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）引起的毀滅性病害，嚴(yán)重威脅著世界馬鈴薯生產(chǎn)［1，2］。致病疫霉屬于異宗配合菌物，有A1 和A2 兩種交配型，1956年墨西哥首次證實(shí)存在A2交配型，其他地區(qū)只有A1交配型。20世紀(jì)80年代以后，世界各地相 繼 發(fā) 現(xiàn)A2 交 配 型［3，4］，1996年 后 中 國 馬 鈴 薯 主栽區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)A2交配型［5－7］。A2交配型的出現(xiàn)意味著病菌可進(jìn)行有性生殖，引起群體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更易產(chǎn)生新的生理小種，從而使晚疫病的流行更為頻繁。與此同時(shí)，國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道該病原菌對常用的藥劑甲霜靈產(chǎn)生了抗藥性［8－10］，化學(xué)防治效果受到了影響，因此，抗病品種的選育和利用顯得尤為重要。

育種實(shí)踐證明，由于晚疫病菌小種較多且變異迅速，很容易克服由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因控制的垂直抗性，使多年培育的品種推廣時(shí)間不長就失去了抗性［2］，而病原小種的快速變異是導(dǎo)致垂直抗性喪失的根本原因。馬鈴薯抗晚疫病育種目標(biāo)已轉(zhuǎn)向利用多基因控制的非特異性的、抗性持久的水平抗性上。但對水平抗性的研究相對較少，特別是病原菌與寄主互作超微結(jié)構(gòu)研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以水平抗性材料和感病品種為研究對象，對接菌后24～72h內(nèi)寄主與病原菌的互作進(jìn)行系統(tǒng)的觀察和分析，探索其組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征，揭示馬鈴薯水平抗性機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 供試品種及來源

馬鈴薯晚疫病水平抗性材料LBr－12（CIP Code：387413.21，親本來源：374080.5×AVRDC1287.19）試管苗由國際馬鈴薯中心駐京辦事處謝開云博士惠贈；感病品種費(fèi)烏瑞它（Favorite）試管苗由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 供試病原菌

致病疫霉（P.infestans）分離自甘肅省定西、渭源和臨洮等縣馬鈴薯主栽地區(qū)病株的混合菌株，在黑麥培養(yǎng)基上18 ℃培養(yǎng)備用。

1.3 馬鈴薯培育與接種

MS培養(yǎng)基上擴(kuò)繁的保存苗生長28d后，移栽至塑料缽（20cm×25cm）中，于18～25℃溫室中培養(yǎng)。生長42d后選取自頂部以下第3－5葉，葉背朝上，置于鋪有濾紙的搪瓷盤進(jìn)行離體接種。游動孢子懸浮液制備參照朱杰華［11］的方法，游動孢子濃度約為5×104個(gè)／mL。接種后用塑料膜保濕24h，以清水處理為對照。接種后24、48和72h取樣，用于固定或染色。

1.4 馬鈴薯葉片組織染色和觀察

葉片接種后不同時(shí)間，用直徑為6 mm 打孔器取樣，每個(gè)品種取5個(gè)葉盤。按Bruzzese［12］方法整葉透明，苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行處理，略加改動，固定染色48h，然后在飽和水合氯醛中脫色48～72h，乳酚油作浮載劑制片，鏡檢。

1.5 葉片組織中菌絲體觀察

參考Eckhard［13］的方法將葉盤置于臺盼藍(lán)乳酚油混合液中加熱煮沸約1 min，將葉盤轉(zhuǎn)入飽和水合氯醛液中浸泡30min以上，在此期間更換1次飽和水合氯醛液。然后以40%甘油作浮載劑制片，用相差顯微鏡觀察。

1.6 透射電鏡樣品的制備和觀察

透射電鏡樣品的處理參考康振生［14］的方法進(jìn)行。將葉片剪成小塊，經(jīng)3%戊二醛和1%四氧化鋨雙固定，系列乙醇脫水，用Epon812樹脂包埋，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置于JEM－100CX 型透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后葉片組織的變化

整葉透明結(jié)果顯示，接種后24h，抗病品種LBr－12葉片在侵染點(diǎn)出現(xiàn)3～4 個(gè)細(xì)胞褐色壞死，即表現(xiàn)為過敏性反應(yīng)（hypersensitive response，HR）（圖1，A）。而感病品種費(fèi)烏瑞它葉片在接種后24h可觀察到侵染點(diǎn)及其相鄰的細(xì)胞沒有出現(xiàn)壞死，而是表現(xiàn)為細(xì)胞顏色加深，即為深綠色，且呈浸潤狀分布（圖1，B）。接種48h后，2個(gè)品種葉片的病斑都進(jìn)一步擴(kuò)大，但抗病品種上擴(kuò)展的速度明顯小于感病品種（圖1，C、D）?？共∑贩N出現(xiàn)褐色的小病斑，而感病品種則出現(xiàn)水漬狀深綠色病斑。

2.2 接種后葉片組織中菌絲體的觀察

臺盼藍(lán)染色和水合氯醛脫色后觀察結(jié)果顯示，接種后24h，病原菌只侵染少量LBr－12細(xì)胞，胞間菌絲被限制在幾個(gè)細(xì)胞間，即受到過敏性壞死限制（圖1，E），而胞間菌絲在費(fèi)烏瑞它葉片細(xì)胞間迅速擴(kuò)展，且產(chǎn)生多個(gè)分支（圖1，F(xiàn)）。接種48h 后，LBr－12葉肉細(xì)胞侵染的數(shù)量增加，侵染點(diǎn)周圍細(xì)胞表現(xiàn)為臺盼藍(lán)染色加深，出現(xiàn)細(xì)胞死亡的跡象（圖1，G）。隨著時(shí)間的推移，費(fèi)烏瑞它接種72h后，胞間菌絲在寄主葉片組織中快速擴(kuò)展，且產(chǎn)生的較多分支（圖1，H）。

2.3 馬鈴薯與致病疫霉互作的超微結(jié)構(gòu)變化

圖1 馬鈴薯葉片組織中致病疫霉的顯微觀察Fig.1 Observation of P.infestans in the potato leaves after staining using microscope

2.3.1 胞間菌絲體的變化 在接種后24h，感病品種費(fèi)烏瑞它中可觀察到大量發(fā)育良好的菌絲細(xì)胞在感病品種細(xì)胞間隙擴(kuò)展，具有多個(gè)細(xì)胞核，菌絲細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及核膜、核仁以及染色質(zhì)清晰可見（圖2，A）；抗病品種LBr－12 在接種后24h，胞間菌絲的形態(tài)基本正常，但液泡增多（圖2，B）。接種36h 后，費(fèi)烏瑞它中胞間菌絲細(xì)胞器正常，液泡增大（圖2，C），抗病品種LBr－12胞間菌絲的細(xì)胞原生質(zhì)的電子致密度加深，液泡增多，菌絲細(xì)胞中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器泡囊化，并融合形成大量泡狀物（圖2，D）。LBr－12 中同時(shí)可見泡狀物與菌絲細(xì)胞質(zhì)膜融和而沉積到菌絲壁上，使得菌絲細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞質(zhì)開始紊亂，線粒體腫脹，菌絲質(zhì)膜和核膜變得模糊，有大量電子致密度高的物質(zhì)從細(xì)胞滲出，菌絲細(xì)胞開始畸形壞死或細(xì)胞器部分解體，細(xì)胞質(zhì)完全解體或變黑（圖2，E）。隨著時(shí)間的推移，LBr－12中泡囊化進(jìn)一步加劇，細(xì)胞器和細(xì)胞核變得模糊不清，細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離，或整個(gè)細(xì)胞也開始解體（圖2，F(xiàn)、G）。

2.3.2 吸器和吸器母細(xì)胞的變化 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種后48h，在抗性品種上病菌的吸器外間質(zhì)加寬，并有電子致密物質(zhì)沉積，即形成吸器鞘（圖版Ⅰ，1）。少數(shù)吸器畸形，吸器壁加厚，原生質(zhì)染色加深，吸器扭曲和外間質(zhì)膜形態(tài)異常、發(fā)育受抑或出現(xiàn)吸器質(zhì)壁分離（圖版Ⅰ，2）。根據(jù)吸器發(fā)育受抑的程度和吸器畸形的特點(diǎn)，可將吸器受抑的類型分為兩類。一類為吸器發(fā)育早期受抑型，吸器體一般不能正常膨大，僅產(chǎn)生一些不規(guī)則的分枝而呈畸形（圖版Ⅰ，3）；另一類為吸器發(fā)育后期受抑，初形成的吸器形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，但進(jìn)一步發(fā)育后，吸器內(nèi)出現(xiàn)一系列的異常變化。包括吸器質(zhì)膜與細(xì)胞核質(zhì)膜電子致密度加深，原生質(zhì)內(nèi)液泡增多且逐漸增大，線粒體腫大破裂和吸器外間質(zhì)不規(guī)則加寬并出現(xiàn)致密度深的物質(zhì)，吸器內(nèi)的細(xì)胞器壞死。在吸器生長受阻和壞死過程中，吸器外間質(zhì)加寬，產(chǎn)生電子致密的顆粒狀物（圖版Ⅰ，4～6）。

2.3.3 寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化 當(dāng)致病疫霉侵染不同抗病品種后，寄主細(xì)胞的反應(yīng)較為復(fù)雜，其抗病反應(yīng)主要涉及寄主細(xì)胞新的防衛(wèi)結(jié)構(gòu)的形成和寄主細(xì)胞的過敏性壞死反應(yīng)。水平抗性品種受侵染后，細(xì)胞壁染色加深以及沉積物的產(chǎn)生，對于增強(qiáng)細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度，限制病原菌擴(kuò)展，具有較強(qiáng)的抵抗作用。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，抗病品種寄主細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)產(chǎn)生抗侵入的乳突狀結(jié)構(gòu)（圖版Ⅰ，7），為抵抗病菌的進(jìn)一步擴(kuò)展，寄主細(xì)胞壁和細(xì)胞膜極度增厚（圖版Ⅰ，8、9），而感病品種在入侵部位未見乳突狀結(jié)構(gòu)。

圖2 馬鈴薯葉片中致病疫霉菌絲的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of hyphae of P.infestans in potato leaves

3 討 論

水平抗性品種雖然其反應(yīng)型表現(xiàn)為中抗，但相對于感病品種，卻表現(xiàn)為病原菌擴(kuò)展緩慢、病斑較小、產(chǎn)量損失較小等特點(diǎn)。這種抗病性在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。水平抗病性機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，至今尚未得出一致的觀點(diǎn)。本研究表明，其主要組織細(xì)胞學(xué)機(jī)制表現(xiàn)為寄主葉肉細(xì)胞過敏性壞死（即HR反應(yīng)），被侵染的細(xì)胞可產(chǎn)生HR反應(yīng)，病菌被限制在侵染點(diǎn)的幾個(gè)細(xì)胞中。與感病品種相比，抗病品種中菌絲產(chǎn)生的分支和吸器較少，病菌的擴(kuò)展受到抑制。在細(xì)胞水平，抗病寄主植物產(chǎn)生細(xì)胞壁沉積物，使細(xì)胞壁增厚，或在病菌的入侵處產(chǎn)生乳突狀結(jié)構(gòu)來阻止病菌的侵入；另外通過細(xì)胞壁在吸器鞘產(chǎn)生沉積物，使病菌的吸器外間質(zhì)加寬，產(chǎn)生纖維狀或顆粒狀物電子致密物質(zhì)［15］，使吸器的功能受到影響。

過敏性反應(yīng)是寄主植物最典型的抗病性機(jī)制。研究表明［16］，在超微結(jié)構(gòu)上，無論是水平抗性還是垂直抗病性，其過敏性反應(yīng)的細(xì)胞學(xué)死亡過程是一致的。Kowalski等［17］在亞麻銹病中將這種數(shù)量性狀抗病性的過敏性反應(yīng)，稱之為“不完全過敏性反應(yīng)”（incomplete hypersensitivity），它在侵染過程的晚期表達(dá)，而且僅出現(xiàn)在部分受侵細(xì)胞中，他認(rèn)為不同類型抗病性發(fā)生過敏性反應(yīng)的本質(zhì)是一樣的。Vleeshouwers等［18］研究顯示，不同馬鈴薯品種出現(xiàn)HR 反應(yīng)的時(shí)間差別顯著，從參與HR 反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目看，抗性水平與HR 效率存在相關(guān)性。水平抗性與垂直抗病性的主要區(qū)別是，HR 反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間和程度的差異，表現(xiàn)為效率較低的HR。他認(rèn)為這可能由于弱化的R 基因?qū)Σ【ぐl(fā)子識別緩慢或識別能力不足造成的，這表明在致病疫霉與馬鈴薯互作體系中，過敏性壞死反應(yīng)是水平抗性馬鈴薯抗晚疫病的重要機(jī)制之一。

植物細(xì)胞受到病原菌侵染時(shí)會出現(xiàn)細(xì)胞壁沉積物，使細(xì)胞壁增厚，這被認(rèn)為是植物抵抗病菌的重要防衛(wèi)反應(yīng)之一［19］。Coffey等［20］對抗病馬鈴薯組織的超微結(jié)構(gòu)觀察表明，感病互作中寄主的細(xì)胞壁缺乏胼胝質(zhì)的積累，而在抗病互作中，進(jìn)入細(xì)胞的吸器周圍沉積大量次生產(chǎn)物，形成一個(gè)鞘狀包被，將吸器與寄主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)隔開，使菌絲擴(kuò)展受到抑制。蔣選利等［21］采用細(xì)胞化學(xué)方法就對小麥與銹菌互作中胞壁沉積物進(jìn)行分析，抗病品種中過氧化物酶的活性在侵染點(diǎn)細(xì)胞以及遠(yuǎn)離侵染點(diǎn)的葉肉細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙中均顯著升高。這些物質(zhì)不僅可以作為抵抗病菌侵入的機(jī)械屏障，而且可以激活防御酶類，提高寄主細(xì)胞的抵抗能力。因此，細(xì)胞壁沉積物的產(chǎn)生可能是馬鈴薯抗晚疫病的結(jié)構(gòu)防衛(wèi)反應(yīng)之一。

除此之外，寄主植物還有其它類型的防衛(wèi)反應(yīng)，如在病菌入侵部位及寄主細(xì)胞內(nèi)側(cè)出現(xiàn)抗侵入的乳突狀結(jié)構(gòu)，寄主細(xì)胞的壞死頻率較低，能在一定程度上阻止病菌的擴(kuò)展。病菌的吸器外間質(zhì)加寬，出現(xiàn)大量電子致密物沉積。這些超微結(jié)構(gòu)在小麥和銹菌的抗病性互作的報(bào)道較多［19，20，22］，但其結(jié)構(gòu)和功能還有待進(jìn)一步研究。

圖版Ⅰ 致病疫霉吸器和LBr－12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)PlateⅠ Ultrastructures of P.infestans haustorium and LBr－12cells

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