杜振廣，肖明明，景士兵，徐紹年*

(1.遼寧省人民醫(yī)院骨腫瘤科，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧省人民醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110016)

實驗研究

EGFR在骨肉瘤中的表達、基因擴增及其臨床意義

杜振廣1，肖明明2，景士兵2，徐紹年1*

(1.遼寧省人民醫(yī)院骨腫瘤科，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧省人民醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110016)

目的 探討表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在骨肉瘤中的蛋白表達及基因擴增，并評估其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的價值。方法 以石蠟包埋組織芯片為材料，分別采用免疫組織化學(xué)PV-9000兩步法與熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)檢測32 例骨肉瘤及10 例骨軟骨瘤中EGFR蛋白表達及基因擴增。結(jié)果 EGFR蛋白在骨肉瘤、骨軟骨瘤中的表達陽性率分別為84.4%、20.0%；擴增陽性率分別為75%、20%；骨肉瘤中EGFR蛋白表達、基因擴增陽性率與骨軟骨瘤相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在骨肉瘤中EGFR蛋白表達、基因擴增陽性率與患者的年齡、性別、腫瘤部位無相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 EGFR與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可以將其作為判斷骨肉瘤生物學(xué)行為的重要參考指標。

骨肉瘤；表皮生長因子受體；免疫組織化學(xué)；熒光

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是骨惡性腫瘤中最常見的一種，目前仍是兒童和青少年惡性腫瘤死亡率很高的疾病[1]。尋找判斷腫瘤的預(yù)后或?qū)εR床治療具有指導(dǎo)意義的分子標記并進行選擇性靶向治療，對提高骨肉瘤治療的效果有重要意義。有學(xué)者報道骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程主要是由于癌基因的激活和抑癌基因的丟失[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族是一種癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與細胞的增殖、調(diào)亡，進而參與細胞惡變。本實驗采用組織芯片免疫組織化學(xué)PV-9000兩步法與熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)檢測32 例骨肉瘤中EGFR表達情況，探討EGFR與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系，為選擇治療方式及判斷患者預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般材料 收集遼寧省人民醫(yī)院2003年1月至2014年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為骨肉瘤的存檔石蠟包埋組織蠟塊32 例(股骨20 例、脛骨8 例、其他4 例)，骨軟骨瘤10 例，術(shù)前均未做過化療及放療。32 例病例中男18 例，女14 例；中位年齡18 歲；骨肉瘤Ennecking外科分期：Ⅰ期3 例，Ⅱa期8 例，Ⅱb期9 例，Ⅲ期12 例；其中失訪8 例，轉(zhuǎn)移者15 例，無轉(zhuǎn)移者9 例。將蠟塊切5 μm切片1張，經(jīng)HE染色后，在蠟塊上選取骨肉瘤組織區(qū)，采用手工組織芯片制備儀，制備成每個瘤組織標本直徑為2 mm組織芯片，從制作好的芯片蠟塊上切5 μm切片3張，分別用于HE染色、FISH及免疫組織化學(xué)分析。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 組織芯片蠟塊制備 預(yù)制受體蠟塊，將受體蠟塊軟化，打孔，固定蠟塊，針點間間隔1 mm，按10×6陣列每個受體蠟塊打孔60個。打孔完成后，放上取樣平臺，將供體蠟塊放在取樣平臺上，使用點樣針在預(yù)先做好取樣標記的供體蠟塊上取樣，將點樣針取出的樣本填入受體蠟塊的蠟孔中，將組織芯片蠟塊放在65℃烤箱中30 min，使其完全熔合，將自然冷卻的組織芯片蠟塊放在冷凍臺上5 min，制備完畢。

1.2.2 免疫組織化學(xué)PV-9000二步法 鼠抗人EGFR單克隆抗體(武漢博士德生物科技有限公司)，PV-9000二步法試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)。組織芯片蠟塊切片脫蠟水化，浸5 min；3%雙氧水室溫孵育10 min，磷酸緩沖液沖洗，滴加稀釋的EGFR抗體(1︰100)，4℃過夜，磷酸緩沖液沖洗，滴加試劑1，37℃孵育20 min，磷酸緩沖液沖洗，滴加試劑2，37℃孵育20 min，磷酸緩沖液沖洗，顯色劑顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封片。用磷酸緩沖液代替EGFR抗體作為陰性對照，陽性對照為已知的EGFR陽性骨肉瘤組織切片。

1.2.3 FISH方法 LSI EGFR/CEP 7探針(北京金菩嘉公司)、蛋白酶K(北京金菩嘉公司)。將組織切片烘烤3 min，脫蠟，脫水，復(fù)水。浸入去離子水中3 min。100℃沸水煮玻片20 min，蛋白酶K終濃度100 μg/m消化；將組織切片置于2XSSC溶液中漂洗5 min，1%甲醛室溫固定10 min。玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，將組織切片室溫浸入丙酮溶液中2 min，自然干燥玻片，加熱玻片至56℃。將10 μL探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封片，準備雜交儀器。共變性條件：83℃ 5 min；42℃ 16 h，玻片洗滌：0.3% NP40 65℃ 1.5 min；0.1% NP40室溫30 s，70%乙醇3 min，暗處自然干燥玻片；室溫，將15 μL DAPI復(fù)染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min，在熒光顯微鏡下選用合適的濾片組觀察玻片。在Olympus BX51型熒光顯微鏡下選用合適的濾片組觀察玻片，以大于75%的細胞核內(nèi)大于等于2個EGFR信號判斷雜交成功。

1.2.4 結(jié)果判讀方法 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀：結(jié)果采用雙盲法，由兩位有經(jīng)驗的醫(yī)師獨立讀片。根據(jù)顯色強度分為陰性、弱陽性、中度陽性和強陽性，分別記分數(shù)為0，1，2，3分。陽性細胞在病變細胞中所占比例大致分為：陽性細胞小于25%，記1分；陽性細胞25%～50%，記2分；陽性細胞數(shù)50%～70%，記3分；陽性細胞數(shù)大于70%，記4分。根據(jù)半定量乘積法，0～3分為(-)，4～6分為(+)，7～8分為(++)，9分以上為(+++)。

FISH結(jié)果判讀探針LSI EGFR/CEP 7為紅/綠雙色，其中EGFR基因為紅色信號，7號染色體著絲粒序列為綠色信號，由兩位病理醫(yī)師隨機計數(shù)細胞觀察，結(jié)果一致方可認定。隨機計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=100個細胞核中紅信號總數(shù)/100個細胞核中綠信號總數(shù))，如果Ratio大于等于2及出現(xiàn)成團集簇擴增細胞視為EGFR基因擴增陽性。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，陽性表達率的比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 在骨軟骨瘤與骨肉瘤中EGFR蛋白表達與基因擴增情況 32 例骨肉瘤中，EGFR蛋白表達陽性27 例(84.4%)，EGFR基因擴增24 例(75.0%)。在10 例骨軟骨瘤中EGFR蛋白表達2 例(20%)，EGFR基因擴增2 例(20%)(見圖1～4)。

圖1 骨肉瘤表達(HE，×400) 圖2 骨肉瘤中EGFR陽性表達(PV9000，×400) 圖3 FISH檢測骨軟骨瘤EGFR基因無擴增(×1000) 圖4 FISH檢測骨肉瘤中EGFR基因擴增，如白色圓圈內(nèi)所示(×1000)

表1 骨軟骨瘤與骨肉瘤中EGFR蛋白表達與基因擴增

2.2 EGFR蛋白表達與基因擴增與骨肉瘤臨床病理因素之間的關(guān)系 Ennecking分期Ⅰ期和ⅡA期EGFR陽性表達率63.6%，ⅡB期和Ⅲ期陽性表達率為95.2%，差異有顯著性(P=0.002)；有轉(zhuǎn)移組中陽性表達率為93.3%，未轉(zhuǎn)移組中陽性表達率為55.6%，差異有顯著性(P=0.047)；EGFR蛋白的表達與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。EGFR基因擴增在骨肉瘤中為75.0%，明顯高于在骨軟骨瘤中的20.0%，差異有顯著性(P=0.006)；Ennecking分期中Ⅰ期和ⅡA期基因擴增為45.5%，ⅡB期和Ⅲ期基因擴增為95.0%，差異有顯著性(P=0.010)；有轉(zhuǎn)移組中基因擴增為86.7%，未轉(zhuǎn)移組中基因擴增為33.3%，差異有顯著性(P=0.021)；EGFR基因擴增情況與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05，見表2)。

表2 EGFR蛋白表達、基因擴增與骨肉瘤臨床病理因素之間的關(guān)系

3 討 論

EGFR是原癌基因的表達產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體[3]。EGFR在多種腫瘤中如結(jié)腸癌[4]、肺癌[5]、食道癌[6]、乳腺癌[7]、子宮頸癌[8]、卵巢癌[9]、胰腺癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]高水平表達。EGFR的表達強度與惡性腫瘤的細胞的增殖、血管的形成、黏附性、是否有轉(zhuǎn)移、對放射敏感性等方面都關(guān)系密切，已經(jīng)成為分子靶向治療的關(guān)鍵點[12]。近年來，分子靶向藥物越來越多的受到重視，當(dāng)前已研發(fā)了相關(guān)EGFR靶向藥，部分已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并取得了較好療效，如EGFR靶向藥吉非替尼、西妥昔等。目前已經(jīng)有10種以上EGFR靶向抑制劑，在針對不同腫瘤的治療中，取得了顯著的療效[13]。

雖然對骨肉瘤的發(fā)病機制還不是很明確，但隨著生命科學(xué)尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因靶向治療為骨肉瘤的治療開辟了一條新途徑。理所當(dāng)然，新基因靶點的尋找就成為了近年來研究的熱門，目前文獻報道EGFR與骨肉瘤關(guān)系都僅限于蛋白表達水平。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與骨軟骨瘤相比，EGFR蛋白在骨肉瘤中高表達，陽性表達率為84.4%，基因擴增為75.0%，表明骨肉瘤具有高表達EGFR的特性，提示骨肉瘤中EGFR高表達在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。在與各臨床病理因素之間的分析研究中發(fā)現(xiàn)，隨著骨肉瘤惡性程度(Enncking外科分期)的遞增，EGFR蛋白陽性表達及基因擴增與之相應(yīng)升高，提示EGFR蛋白表達及基因擴增可以作為骨肉瘤惡性程度及預(yù)后的判斷指標。本課題組在研究中，通過組織芯片篩選，發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中EGFR高表達，因而在本項課題研究中，進一步明確骨肉瘤中EGFR表達的生物學(xué)意義。明確是否可以通過靶向抑制EGFR，而逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞的增殖、黏附、遷移、侵襲等腫瘤的惡性生物學(xué)行為，將為臨床治療是否可以利用EGFR靶向抑制劑治療骨肉瘤、完善骨肉瘤的治療方案、尋找新的骨肉瘤治療途徑提供理論依據(jù)。

綜上所述，EGFR在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。隨著對EGFR的信號通路與骨肉瘤關(guān)系研究的不斷深入，必將能夠為骨肉瘤生物靶向治療提供一種新的生物靶點，為骨肉瘤患者的治愈帶來新的希望。

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The Expression of EGFR Protein，Gene Amplification and Its Clinical Significance in Osteosarcoma

Du Zhenguang1，Xiao Mingming2，Jing Shibing2，Xu Shaonian1

(1.Department of Bone Tumor，People′s Hospital of Liaoning Province，Shengyang 100016，China；2.Department of Pathology，People′s Hospital of Liaoning Province，Shengyang 100016，China)

Objective To investigate the expression of EGFR protein and gene amplification in osteosarcoma and evaluation of EGFR in osteosarcoma occurrence，development and prognosis.Methods PV-9000 two step method and in situ chemical hybridization (FISH) were used to detect the expression of EGFR protein，gene amplification in 32 cases of osteosarcoma and 10 cases of osteochondroma in paraffin-embedded tissue chip material.Results The positive rate of EGFR expresion in osteosarcoma，osteochondroma were 84.4%、20.0%.The positive rate of EGFR gene amplification were 75% and 20%.There were significant differences between osteosarcoma and osteochondroma in the expression and amplification of EGFR.The ex-pression and amplification of EGFR in osteosarcoma had no correlation with age，gender，or the location of the tumor(P>0.05)，but were correlated with metastasis and clinical stage(P<0.05).Conclusion EGFR is closely related to the occurrence and development of osteosarcoma，and can be considered as an important index for determing the biological behavior of osteosarcoma.

osteosarcoma；EGFR；immunohistochemistry；fluorescence

1008-5572(2015)04-0328-04

R738.1

A

2014-09-30

杜振廣(1978- )，男，副主任醫(yī)師，遼寧省人民醫(yī)院骨腫瘤科，110016。

*本文通訊作者：徐紹年