陶永梅,徐丹,王子一,侯立強,王智

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,哈爾濱 150001)

·基礎(chǔ)研究·

大黃素對人宮頸癌裸鼠移植瘤Bcl-2蛋白及其相關(guān)X蛋白表達(dá)的影響

陶永梅,徐丹,王子一,侯立強,王智

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,哈爾濱 150001)

目的 觀察大黃素對人宮頸癌siha、Hela和C33A細(xì)胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)的影響，探討其對宮頸癌的作用機制。方法 建立人宮頸癌siha、Hela和C33A裸鼠移植瘤模型，隨機分為對照組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，分別經(jīng)灌胃給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)0.2 mL/只、大黃素20 mg/kg和大黃素40 mg/kg，1 次/d,共14 d。給藥結(jié)束后處死裸鼠并取瘤組織,采用免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 與相應(yīng)對照組相比較，隨著大黃素劑量增加Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，Bax蛋白表達(dá)逐漸增高。其中大黃素對siha、Hela兩種細(xì)胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于C33A細(xì)胞移植瘤。結(jié)論 大黃素可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長的作用。

宮頸腫瘤;大黃素；bcl-X蛋白質(zhì);bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì);小鼠;近交BALB C

宮頸癌是最常見的婦女惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率居高不下，發(fā)病有年輕化趨勢。臨床研究證明宮頸癌的發(fā)生與高危型的人乳頭瘤病毒(HPV)感染關(guān)系密切，是引發(fā)宮頸癌的重要原因之一[1]。在宮頸癌組織中，尤其是高危型HPV16/18 等亞型在宮頸癌組織中檢出率達(dá)50%～90% ,其感染與宮頸癌的臨床進(jìn)程及預(yù)后有關(guān)，機體的細(xì)胞凋亡調(diào)控機制失衡可能參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程[2-4]。我們前期研究表明大黃素能明顯地抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，而且對siha、Hela兩種細(xì)胞移植瘤抑制效果優(yōu)于C33A細(xì)胞移植瘤。本研究觀察了大黃素對人宮頸癌siha、Hela和C33A細(xì)胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其對宮頸癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大黃素(美國Sigma 公司)；胎牛血清(四季青公司)；青-鏈雙抗、胰酶和二甲基亞砜(DMSO,碧云天)；RPMI-1640和DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；人宮頸癌Siha、HeLa和C33A細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)；兔抗Bcl-2和Bax多克隆抗體(武漢博士德)；二步法二抗PV6001和DAB顯色劑(北京中杉)；其他為國產(chǎn)分分析純。

1.2 實驗動物 清潔級BALB/c/nu雌性小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK京2012-0001)，4～6周齡，體質(zhì)量為18～20 g，飼養(yǎng)條件：SPF級屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫控制在25 ℃，相對濕度控制為40%～60%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 三種細(xì)胞株培養(yǎng)條件如下：Siha細(xì)胞株：RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗；Hela細(xì)胞株：RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗；C33A細(xì)胞株：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。培養(yǎng)條件：37 ℃、5%的CO2、飽和濕度。使細(xì)胞單層貼壁生長，等到70%～80%融合時胰酶消化傳代。

1.4 裸鼠皮下移植瘤的建立及給藥方案 收集對數(shù)生長期的三種細(xì)胞Siha、HeLa和C33A,經(jīng)離心懸浮沉淀后顯微鏡下計數(shù),并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度和計算活細(xì)胞數(shù)；在超凈工作臺內(nèi)無菌條件下將三種細(xì)胞株分別接種于裸鼠右大腿根部皮下，建立A(siha細(xì)胞)、B(Hela細(xì)胞)和C(C33A細(xì)胞)三種細(xì)胞移植瘤的模型。

至第15天左右將已移植成功的各模型裸鼠隨機分成對照組、低劑量組及高劑量組，每組為6只。大黃素：0.1%的DMSO為溶劑，分別配制成0.2% 和0.4%的濃度，待用于裸鼠灌胃給藥。三組裸鼠實驗組分別經(jīng)灌胃給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)0.2 mL/只、大黃素20 mg/kg以及大黃素40 mg/kg，每日給藥1次,如此連續(xù)14 d。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測 給藥結(jié)束后處死裸鼠,剝離腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以積分吸光度(IOD) 代表蛋白相對表達(dá)量，積分吸光度(IOD)=陽性面積×平均吸光度，每組隨機分析6個高倍鏡視野。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性表達(dá)為黃色或黃棕色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析,組間比較t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對人宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)有不同程度的降低，Bax蛋白表達(dá)有不同程度的增高，見表1。

表1 各組人宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

注：與對照組比較,aP<0.01

2.2 大黃素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)有不同程度的降低，Bax蛋白表達(dá)有不同程度的增高，見表2。

表2 各組人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

注：與對照組比較,aP<0.01

2.3 大黃素對人宮頸癌C33A細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，大黃素低劑量和高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)有不同程度的降低，Bax蛋白表達(dá)有不同程度的增高，見表3。

表3 各組人宮頸癌C33A細(xì)胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

注：與對照組比較,aP<0.01,bP<0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)病與細(xì)胞凋亡失衡關(guān)系密切[5],研究顯示Bcl-2/Bax 在宮頸癌組織中存在異常表達(dá)[2-4]。細(xì)胞凋亡是機體中細(xì)胞在生長發(fā)育過程中發(fā)生的一種程序性死亡，涉及復(fù)雜的生理和病理過程,對機體起著極其重要的調(diào)控作用。Bcl-2 家族基因是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因素之一,其中Bcl-2可以抑制細(xì)胞凋亡,Bax 是Bcl-2 的同源基因,可拮抗Bcl-2使細(xì)胞趨于凋亡[6-7]。

大黃素是一種蒽醌類化合物，是中藥大黃等的主要有效成分，研究表明其具有很好的抗腫瘤作用，體外可抑制胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病等多種惡性腫瘤細(xì)胞生長[8]。我們前期研究結(jié)果表明：大黃素能顯著抑制siha、Hela和C33A三種人宮頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的瘤重、生長體積，對siha和Hela細(xì)胞移植瘤作用更為明顯，且呈一定的劑量依賴性。本研究結(jié)果表明:與相應(yīng)對照組相比較，隨著大黃素劑量增加Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，Bax蛋白表達(dá)逐漸增高。其中大黃素對siha、Hela兩種細(xì)胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于C33A細(xì)胞移植瘤。因此我們推測，大黃素可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抑制人宮頸癌裸鼠移植瘤生長的作用。

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黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究(面上)項目(12541757)

陶永梅，副主任藥師，Email:taoyongmei72@163.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.024

2015-01-12)