李龍，蘇迎，李泱，楊水祥

miRNA-377調(diào)控鈣通道蛋白在心房顫動中的作用

李龍，蘇迎，李泱，楊水祥

目的探討miRNA-377(miR-377)與房顫相關離子通道蛋白的靶向調(diào)控關系。方法實驗分為過表達組、干擾組、陰性組和空白組。將L型鈣離子通道α1C亞單位(CACNA1C)的重組熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-377模擬體及陰性對照共轉染于人胚胎腎HEK293細胞，檢測各組熒光素酶的相對活性。將miR-377模擬體、干擾體及陰性對照導入大鼠胚胎心肌H9C2細胞，觀察其對靶基因的表達和功能調(diào)控。結果與陰性組比較，過表達miR-377組CACNA1C熒光素酶相對活性降低31%(0.316±0.006vs0.455±0.008，P=0.009)，過表達組及干擾組CACNA1C、CACNB2基因mRNA表達水平無明顯變化。miR-377模擬體轉入H9C2細胞可抑制CACNA1C蛋白表達(P<0.05)，降低L型Ca電流的密度，使其峰值密度從–3.23±0.64pA/pF降至–2.26±0.16pA/pF(P<0.05)。結論CACNA1C基因可能是miR-377的直接靶基因，miR-377可能通過抑制CACNA1C的表達從而降低L型鈣電流來參與房顫電重構，有可能成為房顫干預治療的靶點。

心房顫動；微RNAs；離子通道；鈣通道，L型；膜片鉗技術

心房顫動(房顫)是心血管疾病患者死亡的重要原因之一[1-2]。房顫是常見的由一系列心臟疾病引起心房重構的終點事件，其本身也能引起心房重構從而促進心律失常的發(fā)展[3]。射頻消融手術是目前治療房顫的主要方法之一，但術后復發(fā)率仍較高[4]。房顫的發(fā)病機制至今尚不清楚，且缺乏有效的早期預警診斷方法。研究表明，微小RNA(microRNAs，miRNAs)參與調(diào)控房顫相關的多種基因[5-7]。miRNAs是一類包含21個左右核苷酸的非編碼小分子RNA，在轉錄后的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA通過與mRNA非翻譯區(qū)完全或不完全結合誘導mRNA降解或阻止其翻譯，廣泛調(diào)控機體的發(fā)育和代謝過程[8]。對行射頻消融術治療的房顫患者miRNA表達譜的相關研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者術前外周血miR-377表達水平相對正常對照上調(diào)4.27倍，而其術后表達水平僅為自身術前的1/102.9[9]。為進一步探索miR-377在房顫發(fā)病機制中的作用，本研究結合Targetscan等軟件預測miR-377的靶基因，并對預測結果采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證，應用過表達和干擾等手段在大鼠心肌H9C2細胞中檢測CACNA1C等的mRNA和蛋白表達水平，并通過膜片鉗技術觀察miR-377對L型Ca電流的影響，明確其內(nèi)源性活性和生理學作用，旨在預測其在房顫發(fā)生發(fā)展及預后中的調(diào)控意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎HEK293細胞及大鼠胚胎心肌H9C2細胞(協(xié)和細胞中心)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，美國)，陽離子脂質(zhì)體Lipo 2000 及Opti-MEM培養(yǎng)液(Life公司，美國)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Promega公司，美國)。Has-miR-377模擬體Mimics、干擾體Inhibitor(上海吉瑪公司)，miRneasy mini Kit(Qiaqen公司，德國)，反轉錄及qPCR試劑(北京TransGen公司)，抗CACNA1C小鼠單克隆抗體(ab84814)、抗CACNB2小鼠單克隆抗體(ab93606)(Abcam公司，英國)，抗GAPDH小鼠單克隆抗體(TA-08)、辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

鈣電流的細胞外液(mmol/L)：NaCl 125、BaCl210.8、MgCl21.0、CsCl 5.4、Glucose 10，Hepes 10、NaOH調(diào)定至pH 7.35。鈣電流的細胞內(nèi)液(mmol/L)：CsCl 120、MgCl23.0、EGTA 10、Mg-ATP 5、Hepes 5，CsOH調(diào)定至pH 7.3。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預測 采用在線數(shù)據(jù)庫篩選miR-377的靶基因，取3個主要數(shù)據(jù)庫(Targetscan、miRanda、miRDB)的交集，并結合文獻報道選擇與房顫電重構相關且得分較高的離子通道基因作為進一步實驗的候選基因。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測 電壓門控L型鈣離子通道α1C亞基(CACNA1C)重組熒光素酶質(zhì)粒由Invitrogen公司設計合成。將處于對數(shù)生長期的HEK293細胞按每孔5×105個細胞接種于6孔板，在細胞覆蓋率90%時進行轉染實驗，轉染前更換Opti-MEM培養(yǎng)液。實驗分為過表達組、干擾組、陰性組和空白組4組。CACNA1C重組熒光素酶質(zhì)粒的量為250ng，miR-377模擬體及陰性對照的濃度為60nmol/L，將Lipo 2000與Opti-MEM混合，室溫靜置30min，共轉染至HEK293細胞中，培養(yǎng)4～6h后，更換完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h后取樣檢測。棄細胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次；每孔加入600μl細胞裂解液，室溫搖動裂解15min；將裂解液移至離心管，12 000×g離心30s，將上清轉移至干凈的離心管；測量皿中加入100μl螢火蟲熒光素酶檢測試劑Ⅱ；加入20μl細胞裂解液，用移液器混勻，置分光光度計讀值，記錄數(shù)據(jù)；加入100μl海腎熒光素激活液(Stop & Glo)，混勻，讀值并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 qRT-PCR檢測基因的mRNA表達 同上，將m i R-4 2 7 9模擬體、干擾體及陰性對照(濃度60nmol/L)轉染至大鼠心肌H9C2細胞，繼續(xù)培養(yǎng)4 8 h，提取各組細胞總R N A，NanoDrop2000評估各樣本的質(zhì)量，A260/A280在1.8～2.1，A260/A230>1.8為合格。各樣本上樣1μg，隨機反轉錄為cDNA。CACNA1C上游引物5'-GATGCAAGACGCTATGGGCTATGAG-3'，下游引物5'-GCATGCTCATGTTTCGGGGTTTGTC-3'，CACNB2上游引物5'-GGACCACTGTTTCTTGCTTG T-3'，下游引物5'-GCATGCTCATGTTTCGGGGTTT GTC-3'；內(nèi)參β肌動蛋白上游引物5'-CTGCTGACTT GGCATTAAGA-3'，下游引物5'-AAAGAAAGGGTGT AAAACGCA-3'。以對照組第一個樣本為參照樣本，采用2-ΔΔCt法評估各組相對表達數(shù)值。實驗重復3次。

1.2.4 Western blotting檢測CACNA1C、CACNB2蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，采用BCA法定量，每孔上樣60μg，8%分離膠、6%濃縮膠電泳，至梯度緩沖液跑至膠底部停止，4℃ 250mA恒流電轉3h，5%脫脂奶粉封閉2h，加入抗CACNA1C小鼠單克隆抗體(1:200稀釋)、抗CACNAB2小鼠單克隆抗體(1:500稀釋)、內(nèi)參GAPDH小鼠單克隆抗體(1:1000稀釋)4℃孵育過夜，洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(1:3000稀釋)室溫避光孵育50min，洗膜3次，每次10min。增強化學發(fā)光法曝光，暗室顯影10min，定影1min。讀片。

1.2.5 膜片鉗技術檢測L型鈣電流 在全細胞膜片電壓鉗模式下記錄L型鈣電流，膜片鉗放大器為AXON-700B，信號控制軟件為pCLAMP 10.4，玻璃毛坯(GG-17)經(jīng)微電極拉制儀(Narishige，pp-830)拉制成玻璃電極，電阻為3.0～4.5MΩ，調(diào)節(jié)三維操縱器進行封接，使封接電阻達1GΩ以上。測定電容時，刺激方案為0.4V/s的斜坡刺激，按公式Cm=I/(dV/dt)計算膜電容(Cm)；為消除細胞間誤差，電流值以電流密度，即電流幅值與細胞電容的比值(pA/pF)表示。

刺激方案：ICa-LI-V曲線：電壓鉗模式，鉗制電位–40mV，階躍10mV，–40～+50mV的系列去極化脈沖刺激，持續(xù)150ms，求算pA/pF。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，如方差不齊采用Kruskal-Walls法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 靶基因預測 以Targetscan為主要軟件預測的可能靶基因為：①CACNA1C，此為L型鈣通道核心亞基；②電壓門控L型鈣通道β亞基(CACNAB2)，此為L型鈣通道輔助亞基。具體數(shù)據(jù)為：人CACNA1C非翻譯區(qū)，NM_000719.6，人KCNB2非翻譯區(qū)，NM_000219.4。含有上述非翻譯區(qū)的重組熒光素酶質(zhì)粒交由Invitrogen公司合成。

2.2 雙熒光素酶相對活性分析 將含有CACNA1C非翻譯區(qū)的重組熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-377模擬體及陰性對照共轉染于人胚胎腎HEK293細胞48h后，檢測熒光素酶的活性。分析發(fā)現(xiàn)，與陰性組比較，過表達組相對熒光素酶活性降低31%(0.316±0.006vs0.455±0.008，P=0.009)，而干擾組相對熒光素酶活性與陰性組比較差異無統(tǒng)計學意義(0.489±0.003vs0.455±0.008，P=0.094，圖1)。

圖1 各組螢火蟲/海腎熒光素酶相對值Fig.1 Relative activity of firefly/renilla luciferase in each group(1)P<0.05 compared with negative control (NC) group

2.3 miR-377對CACNA1C mRNA表達水平的影響 將miR-377模擬體、干擾體及陰性對照分別轉染大鼠胚胎心肌細胞48h后，qRT-PCR檢測顯示，過表達組CACNA1C mRNA表達水平為0.820±0.058，干擾組為0.898±0.061，陰性組為0.883±0.087，空白組為1.042±0.030。過表達組和干擾組mRNA表達水平與陰性組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.329、P=0.923)；與空白組比較，過表達組mRNA表達水平下調(diào)21%(P=0.011)，而干擾組mRNA表達水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.099，圖2)。

2.4 miR-377對CACNB2 mRNA表達水平的影響將miR-377模擬體、干擾體及陰性對照分別轉染大鼠胚胎心肌細胞48h后，qRT-PCR檢測顯示，過表達組CACNB2 mRNA表達水平為1.177±0.077，干擾組為1.048±0.095，陰性組為1.116±0.097，空白組為0.984±0.090。過表達組和干擾組mRNA表達水平與陰性組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.637、P=0.739)；與空白組比較，過表達組mRNA表達水平上調(diào)19%(P=0.006)，而干擾組mRNA表達水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.748，圖3)。

圖2 miR-377對CACNA1C mRNA表達水平的影響Fig.2 Effects of miR-377 on the expression level of CACNA1C mRNA (qRT-PCR) (1)P<0.05 compared with blank group

圖3 miR-377對CACNB2 mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of miR-377 on the expression level of CACNB2 mRNA (qRT-PCR) (1)P<0.05 compared with blank group

2.5 miR-377對CACNA1C、CACNB2蛋白表達的影響 將miR-377模擬體、干擾體及陰性對照轉染大鼠胚胎心肌細胞48h后，Western blotting檢測顯示，過表達組CACNA1C蛋白表達水平明顯下降，與陰性組和空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，干擾組CACNA1C蛋白表達水平增加，與陰性組和空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；過表達組CACNB2蛋白表達水平增加，與陰性組和空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，干擾組CACNB2蛋白表達水平明顯下降，與陰性組和空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

2.6 miR-377對L型Ca電流密度的影響 將miR-377模擬體及陰性對照轉染大鼠胚胎心肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術檢測L型Ca電流密度的改變，結果顯示，當刺激電位為10mV時，ICa-L峰值密度為–3.23±0.64pA/pF，過表達miR-377使ICa-L密度峰值降低至–2.26±0.16pA/pF(n=15，P<0.05)。I-V曲線顯示，過表達miR-377后，ICa-L密度降低，尤其以峰值附近為甚，但沒有改變峰值電位、翻轉電位和I-V曲線形狀(圖5)。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA與房顫心房重構密切相關。Lu等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-328可下調(diào)L型鈣通道α亞基，使動作電位時程縮短，促進房顫的維持。miR-26可上調(diào)內(nèi)向整流鉀通道，也促進房顫的維持[11]，miR-29可降低上調(diào)膠原蛋白1A1和3A1，促進細胞外基質(zhì)的沉積，促進心房結構重構[12]。目前公認miRNA可以指導效應復合物RISC通過兩種不同的機制下調(diào)靶基因的表達，如miRNA的種子區(qū)(5'端2-8nt)與靶基因mRNA 3'端非翻譯區(qū)完全互補，則降解靶基因mRNA，常見于植物，如果與靶基因mRNA不完全互補，則會引起靶mRNA翻譯的抑制，常見于動物[13]。

圖4 miR-377對CACNA1C、CACNB2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of miR-377 on the protein levels of CACNA1C and CACNB2 (Western blotting)(1)P<0.05 compared with blank group; (2)P<0.05 compared with negative control (NC) group

圖5 miR-377對大鼠H9C2細胞ICa-L的影響Fig.5 Effects of miR-377 on L-type calcium current of rat's H9C2 cells (Patch clamp)A. Recordings of ICa-Lof rat's H9C2 cells. Currents elicited by 150ms depolarized pulse –40-+50mV. B. Current-voltage relationship of ICa-Lof two groups

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者射頻消融術前外周血miR-377表達與正常對照組比較明顯上調(diào)，而術后則明顯下降[9]，表明房顫射頻消融術不僅起到電隔離的作用，而且改變和恢復了調(diào)控離子通道蛋白的主要miRNAs表達異常[14]，對房顫的電重構起到了離子流逆重構的作用，同時循環(huán)miR-377可能成為手術療效和房顫預后的新靶標。

本研究結合熒光素酶、PCR、免疫印跡和膜片鉗技術，探索房顫相關miR-377的靶基因及其功能學作用。雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，miR-377過表達組CACNA1C的雙熒光素酶活性明顯下調(diào)，提示miR-377與CACNA1C的非翻譯區(qū)可結合。CACNA1C編碼L型Ca通道的α亞基(核心亞基)，與輔助亞基CACNB1作為miR-328的靶基因在房顫中發(fā)揮重要作用[10]。另有學者發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過調(diào)節(jié)CACNA1C和輔助亞基CACNB2減少ICa-L電流，可能是房顫的重要機制之一[15]。為進一步探索miR-377在心臟中的作用，結合熒光素酶結合實驗，本研究將miR-377模擬體導入大鼠胚胎心肌H9C2細胞，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，miR-377過表達組CACNA1C mRNA表達水平無明顯改變，蛋白表達水平明顯下調(diào)，提示miR-377并未影響CACNA1C的轉錄，而是通過阻止蛋白翻譯來發(fā)揮作用，這種miRNA轉錄后調(diào)控機制在動物體內(nèi)常見，與大多數(shù)文獻報道一致[16]。與對照組相比，miR-377過表達組CACNB2的蛋白水平略上調(diào)，機制尚不清楚，一種可能是CACNB2并非miR-377的直接靶基因，miR-377通過其他途徑間接促使了CACNB2的表達上調(diào)，另一種可能是CACNB2的確是miR-377的靶基因，有文獻報道某些miRNA會上調(diào)靶基因的表達，這種解釋值得商榷。過表達miR-377通過減少Ca通道核心亞基CACNA1C蛋白表達量，使心肌動作電位平臺期L型Ca電流密度降低，心房有效不應期縮短，動作電位時程縮短及傳導速度減慢，從而有利于房顫的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)一個新的miRNA分子miR-377可能參與房顫調(diào)控，并進一步證實其可能通過靶基因CACNA1C發(fā)揮作用，未來可能成為房顫的重要干預靶點。雖然本實驗證實了miR-377可下調(diào)CACNA1C的表達水平，并降低L型Ca電流的密度，但尚有不足，即通過房顫模型觀察miR-377對L型Ca電流的改變，另外，雖然發(fā)現(xiàn)miR-377在大鼠心肌細胞具有內(nèi)源性活性，但尚未在人的心房肌細胞得到證實。近年來干細胞技術逐漸成熟，下一步擬考慮選用誘導多能干細胞(iPSCs)制備人心肌細胞，并在房顫動物模型層面進一步觀察，為深層次地認識miR-377對于房顫的作用提供依據(jù)。

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The role of miR-377 on atrial fibrillation by regulating calcium channel proteins

LI Long1,SU Ying1,LI Yang2,YANG Shui-xiang1*1Department of Cardiology,Peking University Ninth School of Clinical Medicine,Beijing 100038,China
2Institute of Geriatric Cardiology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: sxyang68@163.com

,E-mail: sxyang68@163.com
This work was supported by Beijing Natural Science Foundation (7083108)

ObjectiveTo explore the effect of targeted regulation of miR-377 on atrial fibrillation (AF)-associated ion channel protein by means of overexpression and interference.MethodsThe study designs 4 groups as follows: overexpression,interference,negative control and blank groups. The recombinant luciferase reporter plasmids,miR-377 mimics and negative control mimics were co-transfected into HEK293 cells,and the relative activity of luciferase in each group was assayed. MiR-377 mimics,inhibitor and negative control mimics were transfected into H9C2 cells to investigate the effect on regulation of target gene expression and function.ResultsThe relative activities of CACNA1C recombinant plasmids luciferase were lower in miR-377 overexpression group than that in negative control group (0.316±0.006vs0.455±0.008,P=0.009). The mRNA levels of CACNA1C and CACNB2 showed no significant difference in overexpression group or interference group compared with that in negative control group. The CACNA1C protein expression was inhibited by miR-377 mimics-transfected H9C2 cells,and L-type calcium current peak density decreased from –3.23±0.64pA/pF to –2.26±0.16pA/pF (P<0.05).ConclusionVoltage-gated L-type calcium channel alpha subunit CACNA1C is probably the direct target gene of miR-377,and it may become a new AF intervening target in future by influencing CACNA1C expression,L-type calcium current as well as AF electrical remolding.

atrial fibrillation; microRNAs; ion channels; calcium channels,L-type; patch-clamp technique

R541.75

A

0577-7402(2015)12-0955-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.04

2015-09-06；

2015-10-19)

(責任編輯：張小利)

北京市自然科學基金(7083108)

李龍，碩士研究生。主要從事心臟電生理方面的研究

100038 北京 北京大學第九臨床醫(yī)學院(李龍、蘇迎、楊水祥)；100853 北京 解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所(李泱)

楊水祥，E-mail：sxyang68@163.com