王 婧, 張春枝

一株磷脂酶D高產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

王 婧, 張春枝

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

磷脂酶D可以催化合成磷脂酰絲氨酸,為了得到高活力的磷脂酶D,采用蛋黃平板法從油脂廠區(qū)的土壤中篩選出產(chǎn)磷脂酶D的菌株X1。通過搖瓶培養(yǎng),用TLC薄層層析法測定酶活力,達(dá)到2 023 U/L。對發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,葡萄糖為碳源10 g/L,蛋白胨為氮源15 g/L,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵液初始p H為7,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min的發(fā)酵條件,酶活力達(dá)到最大,為7 330 U/L。

磷脂酶D產(chǎn)生菌;篩選;發(fā)酵優(yōu)化;酶活力

0 引 言

磷脂酶D(phospholipase D,簡稱PLD)能催化水解卵磷脂釋放出磷脂酸和膽堿,一些PLD亦能催化磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng),將具有羥基的底物與膽堿的極性頭部進(jìn)行交換反應(yīng),生成新的磷脂[1]。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,簡稱PS)是唯一能調(diào)控細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白功能的磷脂[2]。天然存在的PS量很低,且不容易提取,成本極高,因此廉價高效地合成PS成為當(dāng)今科研研究的重要議題。目前國內(nèi)較多采用酶轉(zhuǎn)化法,以天然卵磷脂為基質(zhì),加入絲氨酸,在磷脂酶D的作用下,生成磷脂酰絲氨酸[3]。近年來,利用磷脂酶D的堿基交換反應(yīng)特性進(jìn)行磷脂改性以及制備單一磷脂和稀有磷脂取得重大進(jìn)展[4]。

劉媛媛等[5]通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化,磷脂酶D活力達(dá)到3 230 U/L。郭浩等[6]通過對鏈霉菌進(jìn)行誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化,磷脂酶D活力達(dá)到5 210 U/L。本實驗通過特異培養(yǎng)基篩選出一株磷脂酶D的高效產(chǎn)生菌,之后確定培養(yǎng)基組分及條件優(yōu)化,提高磷脂酶D的活力,為通過磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

源于油脂廠區(qū)的土樣,雞蛋。

1.2培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基(%):蛋黃5,NaCl 0.3,p H自然。平板分離培養(yǎng)基(%):NaCl 0.3,MgSO4·7H2O 0.05,CaCl20.1,蛋黃5,瓊脂2,p H 6～7。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):蛋白胨1,NaCl 0.3, MgSO4·7H2O 0.05,CaCl20.1,蛋黃5。

1.2.2 試 劑

葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、大豆卵磷脂、乙醚、Triton X-100、tris鹽、甲苯、氯仿、甲醇、冰醋酸等。

1.3方法

1.3.1 磷脂酶D產(chǎn)生菌的分離

取土樣1 g,接入50 mL的富集培養(yǎng)基中,32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)液經(jīng)10倍梯度稀釋后,選擇合適濃度涂布于平板分離培養(yǎng)基上。32℃培養(yǎng)30 h,挑取具有透明圈的菌落分離、純化,直至得到單一菌株的純培養(yǎng)物[7]。

1.3.2 酶液的制備

將所得的單一菌株接入裝有50 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。4 000 r/min離心10 min,上清液為酶液。1.3.3 酶活力的測定

采用薄板層析法(TLC法)測定酶活力。磷脂酶D的活力單位定義為:最適條件下(30℃、p H=7),單位時間(1 min)內(nèi),底物被水解1μmol所對應(yīng)的酶量。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取濃度梯度分別為4.5,3.5,3.0,2.5,2.0, 1.5,0.5 mg/m L的卵磷脂的乙醚溶液做標(biāo)樣,取GF254硅膠板放入100℃烘箱烘干后點板,碘蒸汽染色后根據(jù)濃度和斑點面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 酶活力的計算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)合反應(yīng)時間,由公式(1)可計算出酶對底物卵磷脂的水解活力(U/L)。

式中:Δρ為反應(yīng)后與反應(yīng)前底物量的變化, mg/m L;Δt為反應(yīng)前后時間的變化,min;M為卵磷脂相對分子質(zhì)量;V,VE為有機(jī)相反應(yīng)總體積及反應(yīng)中所用酶液體積,m L;D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.4發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 碳 源

改變“1.2.1”中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類,分別以用葡萄糖、蔗糖、淀粉作為碳源,添加量為10 g/L,其他成分不變,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.2 氮 源

以10 g/L的葡萄糖為碳源,用蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸鈉作為氮源,添加量為15 g/L,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.3 發(fā)酵溫度

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵溫度分別設(shè)定為20,25,30,35,40℃,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.4 酵液p H

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵液起始p H分別設(shè)定為4.0, 5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.5 搖床轉(zhuǎn)速

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵液起始p H為8,搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為140,160,180,200,220 r/min,30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1磷脂酶D產(chǎn)生菌的分離篩選

雞蛋中含有大量不溶于水的卵磷脂,因此,以5 g/L蛋黃為唯一碳源的分離平板是不透明的,如果該平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)透明圈,初步說明該菌有降解磷脂的能力,透明圈越大,說明降解能力越強(qiáng)。圖1中,X1菌株呈乳白色,表面光滑,中央隆起,邊緣整齊,透明圈清晰透明。

圖1 蛋黃培養(yǎng)基上X1菌株Fig.1 X1 strains on the yolk medium

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2中,3～9號斑點均為卵磷脂,質(zhì)量濃度依次為4.5,3.5,3.0,2.5,2.0,1.5,1.0, 0.5 mg/m L。根據(jù)圖2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出公式

式中:x為PC斑點面積,y為PC質(zhì)量濃度。

圖2 PC濃度-斑點面積圖Fig.2 The picture of PC concentration-spot area

2.3X1菌株產(chǎn)酶活力的測定

將篩選出的X1菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,離心取上清液即為酶液。用TLC法測定酶活力,達(dá)到2 023 U/L。

2.4碳源及其質(zhì)量濃度

碳源是微生物生長的必需營養(yǎng)元素,微生物對不同的碳源利用程度不同[8]。選擇葡萄糖、蔗糖、淀粉取代原發(fā)酵培養(yǎng)基碳源,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)以葡萄糖為碳源時,酶活力達(dá)到3 210 U/L。原因可能是單糖可直接進(jìn)入代謝途徑被降解,降解速度快于雙糖和多糖。

圖3 碳源對酶活力的影響Fig.3 Effect of carbon sources on the enzyme activity

進(jìn)一步考察適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度,結(jié)果由圖4可知,當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L時,酶活力為4 183 U/L。質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,酶活力也維持在原來水平,不再增大。故選擇葡萄糖質(zhì)量濃度10 g/L為最佳。

圖4 葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活力的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on the enzyme activity

2.5氮源及其質(zhì)量濃度

選擇蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨作為氮源,結(jié)果由圖5可知,當(dāng)以蛋白胨為氮源時,酶活力最大,可達(dá)3 905 U/L。有機(jī)氮有利于菌體的生長和酶活力的提高,而無機(jī)氮對酶活力的提升作用有限[9]。其原因可能是,有機(jī)氮在提供氮源的同時,還可以提供一些微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等。

圖5 氮源對酶活力的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on the enzyme activity

進(jìn)一步考察最適的蛋白胨質(zhì)量濃度,結(jié)果由圖6可知,當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為15 g/L時,酶活力最高,為4 937 U/L。當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度繼續(xù)增大,酶活力維持在原來水平,不再增大。故選擇蛋白胨質(zhì)量濃度為15 g/L最佳。

圖6 蛋白胨質(zhì)量濃度對酶活力的影響Fig.6 Effect of peptone concentration on the enzyme activity

2.6發(fā)酵溫度

微生物群體生長、繁殖最快的溫度為其最適生長溫度,但并不等于其發(fā)酵的最適溫度,所以研究溫度對酶活力的影響是必要的[10]。由圖7可知,在20～30℃溫度范圍內(nèi),酶活力隨溫度增加而不斷增加,在30℃達(dá)到最大,為6 320 U/L。當(dāng)溫度繼續(xù)升高,酶活力呈下降趨勢。原因可能是過高的溫度加快了酶的失活速度。

圖7 溫度對酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on the enzyme activity

2.7發(fā)酵液p H

培養(yǎng)基的p H對微生物的生命活動有較大影響,p H會使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶的電荷發(fā)生變化,從而影響其生物活性。第二是引起細(xì)胞膜電荷變化,導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變[11]。由圖8可知,當(dāng)p H為7.0～8.0時,酶活力最大,為7 330 U/L。當(dāng)p H小于5時,菌體很難生長。

圖8 p H對酶活力的影響Fig.8 Effect of p H on the enzyme activity

2.8搖床轉(zhuǎn)速

在搖瓶裝液量一定的條件下,搖床的轉(zhuǎn)速可通過影響培養(yǎng)基中溶解氧的濃度來影響發(fā)酵結(jié)果[12]。由表1可知,在較低的轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵液的酶活力較低。搖床轉(zhuǎn)速在180～220 r/min對發(fā)酵液產(chǎn)酶影響并不明顯?；诠?jié)約能源方面的考慮,選擇180 r/min為發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速。

表1 搖床轉(zhuǎn)速對酶活力的影響Tab.1 Effect of shaking speed on enzyme activity

3 結(jié) 論

通過蛋黃平板法,從油脂廠區(qū)的土壤中篩選出產(chǎn)磷脂酶D的菌株X1,經(jīng)過搖瓶培養(yǎng),用TLC薄層層析法測定酶活力,達(dá)到2 023 U/L。對發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件優(yōu)化,磷脂酶D活力達(dá)到7 330 U/L。得出最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分:碳源為葡萄糖,最適質(zhì)量濃度10 g/L;氮源為蛋白胨,最適質(zhì)量濃度15 g/L。

PAOLA等[13]對4株鏈霉菌所產(chǎn)的磷脂酶D進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)具有相同的最適反應(yīng)溫度,在35℃時堿基轉(zhuǎn)移活性最高。HAGLSHITA等[14]分離出的磷脂酶D最適p H為7.5,可在p H 7～13的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。趙紫薇等[15]分離的磷脂酶D與本實驗所得磷脂酶D的最適溫度和p H相近,分別為28℃和6.5,但p H適應(yīng)范圍差異大。其分離所得磷脂酶D在p H=9時活性仍有上升趨勢,而本實驗的磷脂酶D在p H大于8時活性開始下降。原因可能是酶的來源不同,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差異所造成的。

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Isolation and properties of a phospholipase D-producing strain

WANG Jing, ZHANG Chunzhi
(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Strains X1 producing phospholipase D was isolated from the soil collected from oil factory using the yolk medium plate.The activity of phospholipase D could reach to 2023 U/L in flask fermentation by TLC.Medium composition and culture condition were optimized for phospholipase D production,which was 10 g/L glucose,15 g/L peptone,temperature 30℃,p H 7.0 and shaking speed of 180 r/min.The maximum phospholipase D activity was increased to 7 330 U/L from 2 023 U/L.

phospholipase D-producing strain;screening;fermentation optimizing;enzyme activity

TS261

:A

1674-1404(2015)05-0326-04

2014-09-22.

王婧(1989-),女,碩士研究生;通信作者:張春枝(1963-),女,教授.