張娟娟，李秀玲，王 培，張 娟，盧 瑩，趙 純，丁 卉，張軍強，凌秀鳳

(南京市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，江蘇 南京210004)

自然周期凍融胚胎移植的影響因素分析

張娟娟，李秀玲，王 培，張 娟，盧 瑩，趙 純，丁 卉，張軍強，凌秀鳳

(南京市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，江蘇 南京210004)

目的 探討影響自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠成功的因素。方法 對南京市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心2011年1月至2013年12月行自然周期凍融胚胎移植治療的282例患者的資料采用非條件Logistic回歸分析法進行分析，并對回歸分析的結(jié)果進行進一步的研究。結(jié)果 患者年齡、卵泡排出時間(其中的hCG注射后24小時內(nèi)排卵組)、移植不同發(fā)育階段胚胎與妊娠結(jié)局相關(偏回歸系數(shù)分別為：-0.052，0.446，-0.081，均P<0.05)。不孕年限、移植胚胎數(shù)目、子宮內(nèi)膜厚度與妊娠結(jié)局無顯著關系(均P>0.05)。肌注絨毛膜促性腺激素(hCG)后24小時內(nèi)卵泡排出者臨床妊娠率高于未注射hCG組及48小時內(nèi)卵泡排出者(χ2值分別為3.880和4.660，均P<0.05)。移植囊胚與卵裂期胚胎相比，具有更高的臨床妊娠率。結(jié)論 年齡、卵泡排出時間、不同發(fā)育時期胚胎是影響自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠的重要因素。

自然周期；凍融胚胎移植；臨床妊娠；Logistic回歸

自1978年世界第1例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)迅速發(fā)展，給成千上萬的不孕不育患者帶來了福音，其中冷凍技術的發(fā)展尤其是玻璃化冷凍技術的逐步成熟，為胚胎移植尋找合適的時機提供了強有力的保障。凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)-ET)常采用自然周期和人工周期兩種不同的方案來準備內(nèi)膜，其中自然周期F-ET具有激素水平接近生理狀態(tài)、用藥量少等優(yōu)點。為提高自然周期F-ET臨床妊娠率提供更多的理論依據(jù)，現(xiàn)對南京市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心2011年至2013共282例自然周期F-ET周期的資料行回顧性分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 基本資料

選取2011年1月至2013年12月在南京市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心接受自然周期方案F-ET的患者282例，其中原發(fā)不育162例，繼發(fā)不育120例。患者年齡21～45歲，平均年齡30.8±4.6歲；不育年限0.5～25年，平均不育年限3.7±2.8年；內(nèi)膜厚度7～17mm(7mm以下取消移植)，平均內(nèi)膜厚度10.0±1.8mm，內(nèi)膜類型為A型或B型。根據(jù)患者的年齡、月經(jīng)周期、優(yōu)勢卵泡的大小、既往B超監(jiān)測排卵的結(jié)果決定是否肌注絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)以及注射hCG的時間；陰道B超監(jiān)測排卵，根據(jù)卵泡排出時間的不同將患者分為未肌注hCG組、肌注hCG后24小時內(nèi)卵泡排出組(24小時組)及48小時內(nèi)卵泡排出組(48小時組)。常規(guī)肌注hCG后48小時仍不排卵者建議取消本次F-ET周期。根據(jù)患者的年齡以及剩余胚胎數(shù)目，移植胚胎數(shù)1～3枚。根據(jù)胚胎冷凍時胚胎發(fā)育階段的不同，分為卵裂期胚胎(取卵后第3天)及囊胚(取卵后第5天及第6天)。

1.2 方法

1.2.1 自然周期凍融胚胎移植的納入標準

①月經(jīng)周期第2～3天基礎內(nèi)分泌檢查正常；②平素月經(jīng)規(guī)則；③既往曾進行自然周期卵泡監(jiān)測證實有優(yōu)勢卵泡發(fā)育并排出。

1.2.2 黃體支持情況

排卵后當天開始行黃體支持，黃體酮每日40mg肌注，持續(xù)至移植后14天。

1.2.3 妊娠標準

術后第14天行血hCG測定，陽性為生化妊娠，繼續(xù)行黃體支持，至術后4周，陰道B超檢查發(fā)現(xiàn)妊娠囊確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.1軟件分析所有數(shù)據(jù)，多因素分析用Logisitc回歸分析法。以妊娠結(jié)局為因變量(非妊娠=0，妊娠=1)，以可能影響臨床妊娠成功的因素，如年齡、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、胚胎天數(shù)、排卵時間為自變量進行多因素Logisitc回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 多因素Logistic回歸分析情況

經(jīng)多因素Logistic回歸分析顯示，年齡、卵泡排出時間(其中的hCG注射后24小時內(nèi)排卵組)、移植不同發(fā)育階段胚胎與妊娠結(jié)局呈顯著相關(均P<0.05)；不孕年限、移植胚胎數(shù)目、子宮內(nèi)膜厚度與妊娠結(jié)局無顯著關系(均P>0.05)，見表1。

表1 影響自然周期F-ET臨床妊娠因素的Logistic回歸分析結(jié)果

Table 1 Logistic regression analysis of clinical pregnant factors affecting natural cycle F-ET

2.2 患者基本資料與臨床妊娠情況

為進一步驗證并分析Logistic回歸分析的結(jié)果，按是否臨床妊娠將患者分為臨床妊娠組及未臨床妊娠組，并對年齡、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度及移植胚胎數(shù)目進行分析，兩組的年齡比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

Table 2 Comparison of basic situations between clinical pregnant group and non-pregnant group

2.3 卵泡排出時間與臨床妊娠

肌注hCG后48小時內(nèi)卵泡仍未排出但患者夫婦堅持要求移植者僅3例，均未獲臨床妊娠，因樣本量少未納入以下統(tǒng)計。

未肌注hCG組共146個周期，臨床妊娠率46.6%，低于肌注hCG后24小時組臨床妊娠率59.8%，但高于肌注hCG后48小時臨床妊娠率40.4%。24小時組與未用hCG組和48小時組比較均具有較高的臨床妊娠率，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為3.880和4.660，均P<0.05)，見表3。

表3 不同卵泡排出時間的臨床妊娠結(jié)果比較[n(%)]

Table 3 Comparison of clinical pregnancy outcomes among cases with different timing of follicles discharge[n(%)]

2.4 不同發(fā)育階段胚胎與臨床妊娠情況

根據(jù)胚胎冷凍時胚胎發(fā)育階段的不同分為卵裂期胚胎組及囊胚組，移植卵裂期胚胎101個周期，囊胚181個周期(其中移植第5天囊胚為172周期，移植第6天囊胚為9個周期)；卵裂期胚胎組臨床妊娠率低于移植囊胚組(χ2=3.890，P<0.05)，見表4。

表4 不同胚胎發(fā)育階段的臨床妊娠結(jié)果比較[n(%)]

Table 4 Comparison of clinical pregnancy outcomes between embryos at different development stage [n(%)]

3 討論

3.1 年齡對自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠的影響

本研究中通過Logist回歸分析發(fā)現(xiàn)，自然周期F-ET的臨床妊娠率與女性的年齡呈負相關。有研究證明，隨著年齡的增長，卵子中過氧化物(如氧自由基等)的增加使卵子中線粒體數(shù)量明顯減少，卵泡漿內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)的合成下降，ATP與谷胱甘肽/雙巰基谷光甘肽(GSH/GSSH)比例下降，同時，細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，增加了對處于第1次減數(shù)分裂靜止期卵子的破壞作用，造成卵細胞染色體異常的幾率增加，使卵子質(zhì)量下降，從而使胚胎質(zhì)量下降，降低了臨床妊娠率[1]。

3.2 子宮內(nèi)膜厚度對自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠的影響

子宮內(nèi)膜容受性是決定妊娠成敗的關鍵因素。有研究表明子宮內(nèi)膜厚度<7mm時胚胎難以著床[2]。本研究中所有移植患者子宮內(nèi)膜厚度均≥7mm，因而不存在內(nèi)膜過薄而影響妊娠結(jié)局的病例。Logist回歸分析結(jié)果顯示，當子宮內(nèi)膜厚度均≥7mm時，子宮內(nèi)膜厚度與臨床妊娠率無關，這與Binder等[3]對子宮內(nèi)膜厚度與子宮內(nèi)膜容受性無關的研究結(jié)果一致。另有Yaman等(2000年)對65例體外受精與胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的患者hCG注射日子宮內(nèi)膜厚度與IVF-ET結(jié)局進行分析，認為hCG注射日的子宮內(nèi)膜厚度不能預測妊娠的發(fā)生。

3.3 卵泡排出時間對自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠的影響

有報道顯示，宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine inseminatio，IUI)術后24小時B超監(jiān)測有排卵者妊娠率遠遠高于未排卵者的妊娠率[4]。本研究中發(fā)現(xiàn)，24小時組較48小時組有較高的臨床妊娠率。眾所周知，胚胎與子宮內(nèi)膜的同步成熟是成功植入的必要條件[5]，對于F-ET來說，為胚胎尋找移植窗口期成為臨床工作的目標。子宮內(nèi)膜成熟是受母體卵巢類固醇激素雌二醇(E2)和孕酮(P4)的調(diào)控[6-7]。關于子宮內(nèi)膜容受性的標志物，目前尚無定論，Nikas等(2000年)報道與胞飲突的存在有密切關系。亦有Acosta等(2000年)研究胞飲突的存在與內(nèi)膜的移植窗口期并無直接關系。目前主要還是以子宮內(nèi)膜組織學及顯微電鏡形態(tài)來評估子宮內(nèi)膜的成熟情況。本研究中發(fā)現(xiàn)多數(shù)卵泡排出發(fā)生在hCG注射后的24小時內(nèi)，并非既往研究中的卵泡破裂排卵發(fā)生在使用hCG后24～36小時。因此推測hCG注射后的24小時內(nèi)排卵患者本身的黃體生成素(luteinizing hormone，LH)峰值在hCG發(fā)揮作用前已經(jīng)形成，而非完全依靠hCG的作用；hCG注射后的48小時內(nèi)排卵的患者依賴于hCG誘發(fā)的LH峰值，故而排卵延遲。由此推論，患者本身的LH峰值形成更有利于內(nèi)膜的成熟及內(nèi)膜種植窗的形成。

24小時排卵組較未用hCG組具有更高的臨床妊娠率，因此推測可能與未用hCG組部分患者受地理條件限制未每日監(jiān)測排卵，錯失移植窗口期有關；另外，未用hCG組部分患者卵泡平均直徑<15mm即已排出，其排卵期內(nèi)分泌水平欠佳也是影響未用hCG組妊娠結(jié)局的可能原因之一。本資料受回顧性研究的限制，未能進一步研究及干預，提示若既往自然周期有優(yōu)勢排卵的患者，擬移植周期卵泡發(fā)育欠佳，可考慮取消移植或改行人工周期準備內(nèi)膜。

3.4 移植不同發(fā)育階段胚胎對自然周期凍融胚胎移植臨床妊娠的影響

本研究中囊胚移植較卵裂期胚胎相比具有更高的臨床妊娠率，但目前關于囊胚培養(yǎng)國內(nèi)外均存在很多爭議。ART的目的在于以最小的傷害、最低的經(jīng)濟支出獲得最優(yōu)的臨床妊娠結(jié)局。胚胎質(zhì)量無疑是影響胚胎移植臨床妊娠最關鍵的因素之一。目前對胚胎質(zhì)量的檢測主要還是依靠形態(tài)學進行評分，但越來越多的研究表明，僅僅根據(jù)單一的形態(tài)學評分預測胚胎的發(fā)育潛力是不夠精確的[8]。胚胎早期發(fā)育是極其復雜而精確的，隨著發(fā)育的進展，胚胎呈現(xiàn)不同的生理特征。卵子成熟度、受精卵原核評級、胚胎形態(tài)評分或早期卵裂發(fā)生都與胚胎的發(fā)育潛能有一定的相關性[9]。胚胎基因組的激活始于8～10細胞期，多數(shù)發(fā)育潛能差、染色體異常的胚胎不能從該期發(fā)育到囊胚。卵裂期形態(tài)學評分低的胚胎經(jīng)體外延長培養(yǎng)仍有部分能發(fā)育至囊胚，因此延長“非優(yōu)質(zhì)”胚胎體外培養(yǎng)時間，篩選出具有發(fā)育潛能的胚胎，可以最大限度地利用胚胎，尤其是無“優(yōu)質(zhì)胚胎”或者有“優(yōu)質(zhì)胚胎”但移植后未孕的患者。此外，自然生理狀態(tài)下，早期胚胎在輸卵管中發(fā)育，直到接近囊胚期才進入子宮腔。囊胚縮短了胚胎移植后進一步發(fā)育與著床之間的間隔，且子宮收縮減少，可減少胚胎排出體外[10]。與卵裂期胚胎相比，囊胚移植更符合自然生理現(xiàn)象，可提高臨床妊娠率，因此認為囊胚培養(yǎng)有著重要的臨床價值。

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[專業(yè)責任編輯：呂淑蘭]

Influential factors of clinical pregnancy outcomes of women receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer

ZHANG Juan-juan, LI Xiu-ling, WANG Pei, ZHANG Juan, LU Ying, ZHAO Chun, DING Hui, ZHANG Jun-qiang, LING Xiu-feng

(ReproductiveMedicalCenterofNanjingMaternalandChildHealthHospital,JiangsuNanjing210004,China)

Objective To investigate the influential factors of clinical pregnancy outcomes of women receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer. Methods Non-conditional Logistic regression analysis was conducted on the clinical data of 282 cases receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer during the period of January 2011 to December 2013 in Nanjing Maternal and Child Health Hospital. Results Patient’s age, ovulation (happened within 24 hours after hCG intramuscular injection) and embryo at different stage were correlated with pregnancy outcomes (partial regression coefficient was -0.052, 0.446 and -0.081, respectively, allP<0.05). Duration of infertility, endometrial thickness and the number of embryo transplantation had no relation with clinical pregnancy outcomes (allP>0.05). Cases whose ovulation happened within 24 hours after hCG intramuscular injection got higher clinical pregnancy rate than that of the cases without hCG injection and those whose follicles discharged within 48 hours after hCG injection (χ2value was 3.880 and 4.660, respectively, bothP<0.05). Besides, blastocysts were easier to grow compared with embryos at cleavage stage. Conclusion Age, the timing of ovulation and embryo at developmental stages are the key influential factors of natural cycle frozen-thawed embryo transfer.

natural cycle；frozen-thawed embryo transfer；clinical pregnancy；Logistic regression analysis

2014-10-08

張娟娟(1986-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事生殖醫(yī)學的研究。

凌秀鳳，主任醫(yī)師/副教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.036

R714.7

A

1673-5293(2015)03-0503-03