李鵬，鄭芳，李聰，李志浩，黃麟杰，朱雪松

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部、武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，十堰 442008)

HPLC-DAD法同時測定“武當二號”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量*

李鵬，鄭芳，李聰，李志浩，黃麟杰，朱雪松

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部、武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，十堰 442008)

目的 建立同時測定“武當二號”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷含量高效液相色譜測定方法。方法 采用Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)進行梯度洗脫；檢測波長350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫32 ℃。結果 綠原酸、木犀草苷分別在進樣量0.285～2.280，0.124～1.240 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)分別為0.999 3，0.999 4；平均加樣回收率分別為98.9%，98.8%(n=6)，RSD分別為1.59%，1.84%。結論 該方法準確、快速、重復性好，可以用來同時測定“武當二號”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量。

“武當二號”忍冬葉；綠原酸；木犀草苷；檢測器，高效液相色譜法-二極管陣列

“武當二號”忍冬為樹形忍冬即木本忍冬，為湖北武當生物醫(yī)藥科技有限公司將山東“亞特良種忍冬(LonicerajaponicaYatehong LSB)”(經(jīng)國家林業(yè)局審定)與武當?shù)貐^(qū)忍冬相結合進行培育，培植出適合十堰地區(qū)生長的優(yōu)良獨特品種。該品種不同于普通的藤本忍冬品種(把傳統(tǒng)藤本培育成小灌木)，生長快，一年可采四季，采收省工，且產(chǎn)量是傳統(tǒng)品種的數(shù)倍，具有很高的經(jīng)濟價值和藥用價值。金銀花是我國常用中藥材，具有疏散風熱、清熱解毒的功效[1]。忍冬的葉即忍冬葉與金銀花均有清熱解毒之功效[2]，每年隨著忍冬植株整形修剪可以得到大量的枝葉，其產(chǎn)量是花的數(shù)倍，但作為金銀花副產(chǎn)物，忍冬葉一直被視為非藥用部位而未得到充分利用，造成了極大的資源浪費[3]。忍冬葉主要化學成分為綠原酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類等，目前研究的重點是綠原酸類和黃酮類，也是發(fā)揮藥效作用物質基礎[4]?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版一部已將綠原酸(有機酸類)和木犀草苷(黃酮苷類)作為金銀花的質量控制指標，但“武當二號”忍冬葉中有關綠原酸、木犀草苷的含量測定方法筆者未見文獻報道。本實驗參考相關文獻[5-12]，采用反相高效液相色譜法同時測定“武當二號”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷的含量，操作簡便、快速、重復性好，為建立“武當二號”金銀花葉質量標準提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000 高效液相色譜儀(DIONEX)，UltiMate3000 Photodioce Array Detector(DIONEX)，UltiMate 3000 Pump(DIONEX)，Chromeleon色譜工作站(DIONEX)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機[CZX-OH-40X4-5型，額定頻率(50±1) Hz，天津市泰斯特儀器有限公司]；電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；AEU-210萬分之一電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 試藥 綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200212)；木犀草苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111720-200604)；武當二號忍冬葉2013年5月采自湖北武當生物醫(yī)藥科技有限公司種植園，經(jīng)湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院武當研究所陳吉炎教授鑒定為忍冬科植物紅白忍冬[LonicerajaponicaThunb.var.chinensis(Wats.) Bak.] 的干燥葉；乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；冰醋酸為科密歐色譜純試劑(天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心)；甲醇(分析純，批號：20110913)、無水乙醇(分析純，批號：20110515)，均購于武漢市中天化工有限責任公司；水為經(jīng)檢驗合格的自制注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱：Phenomenex ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，進行梯度洗脫，洗脫程序為：0～6 min，A：B=13：87；～7 min，A13%→20%，B87%→80%；～17 min，A：B=20：80；～18 min，A20%→13%，B80%→87%；～25 min，A：B=13：87；檢測波長350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫32 ℃；進樣量10 μL。依照上述色譜條件，分別進樣綠原酸、木犀草苷對照品溶液、“武當二號”忍冬葉樣品溶液，記錄色譜圖(圖1)。結果綠原酸、木犀草苷保留時間分別約為5.7，13.3 min，理論板數(shù)按綠原酸峰計不低于7 000，按木犀草苷峰計不低于40 000，且各色譜圖中綠原酸和木犀草苷峰的DAD匹配值均不低于999.8，說明綠原酸和木犀草苷峰基本為純峰[12]。

2.2 對照品溶液制備 稱取綠原酸對照品57.0 mg，加50%甲醇溶解稀釋，配制成0.57 mg·mL-1對照品儲備液，取適量用50%甲醇稀釋10倍，得57 μg·mL-1對照品溶液；精密稱取木犀草苷對照品6.2 mg，加70%乙醇溶解稀釋，配制成62 μg·mL-1對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取在40 ℃下，于電熱恒溫干燥箱中干燥的“武當二號”忍冬葉(過孔徑0.25 mm 篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密稱定，回流2 h，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用孔徑0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液適量為供試品溶液。

2.4 標準曲線的繪制 在“2.1”項色譜條件下，分別進樣“2.2”項下的綠原酸對照品溶液0.285，0.570，0.855，1.140，1.710，2.280 μg和木犀草苷對照品溶液0.124，0.248，0.372，0.620，0.930，1.240 μg，記錄各自峰面積。以各自進樣量X(μg)為橫坐標，相對應峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得綠原酸和木犀草苷的回歸方程分別為：Y綠=52.16X綠+1.509(r=0.999 3，n=6)，Y木=52.916X木+0.149 1(r=0.999 4，n=6)，結果表明，綠原酸和木犀草苷進樣量分別在0.285～2.280，0.124～1.240 μg范圍內與其對應的峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度實驗 精密吸取“2.2”項濃度為57 μg·mL-1綠原酸對照品溶液和濃度為62 μg·mL-1的木犀草苷對照品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下，分別重復進樣6次，記錄峰面積，結果綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為0.56%(n=6)，0.69%(n=6)。

2.6 重復性實驗 取同一批號(批號：20130502)的“武當二號”忍冬葉，按“2.3”項方法平行操作，制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣，記錄峰面積并計算綠原酸和木犀草苷含量，結果RSD分別為1.58%(n=6)，1.87%(n=6)。結果表明本方法重復性良好。

A.混合對照品；B.綠原酸對照品； C.木犀草苷對照品；D.“武當二號”忍冬葉樣品；1.綠原酸；2.木犀草苷

A.mixed reference；B.chlorogenic acid control；C.galuteolin control reference；D.“WudangNO.Ⅱ” honeysuckle leaves sample；1.chlorogenic acid；2.galuteolin

Fig.1 HPLC chromatogram of four kinds of solutions

2.7 穩(wěn)定性實驗 精密吸取批號為20130502 “武當二號”忍冬葉(含綠原酸和木犀草苷分別為1.86%，0.23%)的供試品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下，分別于0，4，8，12，16，24 h進樣，記錄峰面積，得綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為0.99%，0.91%，說表明在24 h內供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取“2.7”項已測含量的“武當二號”忍冬葉(批號：20130502)各18份，每份約0.5 g，均分二組。一組分別精密加入濃度為0.93 g·L-1綠原酸對照品溶液8.0，10.0，12.0 mL(各3份)，另一組分別精密加入濃度為0.58 g·L-1木犀草苷對照品溶液1.8，2.0，2.4 mL(各3份)，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，將上述供試品溶液各進樣5 μL(每份進樣3次)，計算平均含量和回收率。結果綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為98.9%，98.8%；RSD分別為1.59%，1.84%，見表1。

2.9 樣品含量測定 按“2.3”項方法，測定3批“武當二號”忍冬葉中的綠原酸和木犀草苷的含量，并與同一批在同樣干燥條件下(40 ℃中電熱恒溫干燥箱中干燥)的“武當二號”金銀花在不同花期(花蕾期、銀花期、金花期)中的綠原酸和木犀草苷的含量做了對比，結果見表2。

表1 綠原酸和木犀草苷加樣回收率實驗結果

Tab.1 Recovery results of chlorogenic acid and galuteolin

組分取樣量/g原有量加入量測得量mg回收率/%綠原酸0.50069.3117.44016.63998.50.50139.3247.44016.890101.70.50439.3807.44016.64197.60.50369.3679.30018.55598.80.51059.4959.30018.53597.20.50429.3789.30018.64199.60.51029.49011.16020.41697.90.50209.33711.16020.27498.00.51119.50611.16020.789101.1木犀草苷0.51071.1751.0442.19998.10.50521.1621.0442.221101.40.52041.1971.0442.21597.50.51511.1851.1602.32498.20.51001.1731.1602.29897.00.50831.1691.1602.32899.90.51231.1781.3922.53997.80.50201.1551.3922.51197.40.51111.1761.3922.594101.9

3 討論

《中華人民共和國藥典》2010年版一部規(guī)定用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB-pheny (250 mm×4.6 mm，5 μm)的色譜柱測定木犀草苷的含量，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱測定綠原酸的含量，本實驗選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時測二成分的含量。曾實驗過大連依利特 Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Shodex Rspak DE C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent HC C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根據(jù)色譜峰的柱效、分離效果、DAD匹配值及重復性等因素綜合考慮，選擇使用Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

表2 樣品中綠原酸和木犀草苷的含量測定結果

Tab.2 Content determination of chlorogenic acid and galuteolin in samples %，n=3

本實驗確定流動相B組分時，比較0.2%，0.4%磷酸溶液和0.2%，0.5%冰醋酸溶液，結果選擇0.4%磷酸溶液時，綠原酸峰和木犀草苷峰的理論板數(shù)最高，且均超過《中華人民共和國藥典》2010年版一部規(guī)定(理論板數(shù)按綠原酸峰計不低于1 000、按木犀草苷峰計不低于20 000)的數(shù)倍；選擇流動相時曾使用等度洗脫，由于“武當二號”忍冬葉的化學成分復雜，雖然其綠原酸達到基線分離，但木犀草苷峰受相鄰峰的干擾很大，其峰的DAD匹配值很難達到999.0，故最終選用本文梯度洗脫程序。

本實驗參考文獻[12]，以50%甲醇為提取溶劑、液料比為100 mL·g-1條件下，分別比較了超聲30，40，50，60，70，80，90 min(超聲功率100 W，頻率40 kHz)和回流60，80，100，120 min的提取率。結果超聲提取時，超聲80 min綠原酸和木犀草苷含量最高；回流提取時，回流120 min綠原酸和木犀草苷含量最高；但回流120 min綠原酸和木犀草苷含量比超聲80 min均高，故本實驗采用回流120 min提取“武當二號”忍冬葉中綠原酸和木犀草苷。

[1] 張繼環(huán)，王萍.不同加工方法對金銀花中木樨草苷含量的影響研究[J].齊魯藥事，2011，30(11)：653-654.

[2] 李玉賢，楊懷霞，武雪芬.金銀花莖葉藥用價值概述[J].河南中醫(yī)藥學刊，2000，15(3)：23-24.

[3] 錢正明，李會軍，李萍，等.高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J].分析化學，2007，35(8)：1159-1163.

[4] 趙金鳳，周鳳琴，郭慶梅，等.忍冬葉研究進展[J].中國藥房，2010，21(39)：3738-3740.

[5] 盧金清，詹曉蓮，徐玉婷，等.高效液相色譜法測定神農(nóng)香菊中綠原酸和木犀草素的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2008，28(19)：1629-1631.

[6] 秦慶芳.HPLC同時測定連花清瘟膠囊中綠原酸、連翹苷、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2014,31(2):210-213.

[7] 黃興振,王志萍,譚珍媛.桂產(chǎn)山銀花栽培品種的鑒定與含量測定[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2013,30(4):395-398.

[8] 黃蓓蓓,賀帥.微乳液相色譜法同時測定注射用雙黃連凍干粉中三組分的含量[J].醫(yī)藥導報 ，2013，32 (1): 92-95.

[9] 郭玉，陽玉聰，劉運美，等.金銀花及其葉中有效成分的比較研究[J].南華大學學報(醫(yī)學版)，2008，36(2)：154-157.

[10] 郭玉，鄭興，曹軒，等.RP-HPLC測定金銀花葉中木犀草苷的含量[J].中成藥，2009，31(8)：1299-1300.

[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：152-153.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：205-206.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.025

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid and Luteoloside in the Leaves of“WudangNo.Ⅱ”Flos Lonicerae by HPLC-DAD

LI Peng, ZHENG Fang, LI Cong, LI Zhihao, Huang Linjie, ZHU Xuesong

(DepartmentofPharmacy,AffiliatedDongfengHospital,HubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan442008,China)

Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae. Methods Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was acetonitrile(A)and 0.4% phosphoric acid aqueous solution(B)by gradient elution mode; the detection wavelength was 350 nm and the flow rate was 0.8 mL·min-1; the column temperature was set at 32 ℃. Results The calibration curve of chlorogenic acid and luteoloside to the peak area was linear in the range of 0.285-2.280 μg(r=0.999 3), and 0.124-1.240 μg(r=0.999 4), respectively.The mean recovery of chlorogenic acid and luteoloside was 98.9%, RSD=1.59% and 98.8%, RSD=1.84%, respectively. Conclusion This method is found to be accurate, quick and reproducible.It can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNO.Ⅱ”flos lonicerae.

Leaves of“WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteoloside; Detector, high performance liquid chromatography-diode array

2013-12-16

2014-07-03

*湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(4)

李鵬(1968-)，男，湖北十堰人，副教授，主任藥師，在讀博士，主要從事醫(yī)院藥學工作。電話：0719-8272346，E-mail：dfyylp@163.com。

朱雪松(1974-)，男，湖北十堰人，副教授，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學工作。電話：0719-8272346，E-mail：dfpharmacy@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0660-04