陳志輝，譚麗容，羅明，黃綺敏，張美玲，魏剛

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006； 2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，江門 529156]

香菇多糖柱前衍生化高效液相色譜指紋圖譜研究*

陳志輝1，譚麗容2，羅明1，黃綺敏2，張美玲2，魏剛1

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006； 2.無(wú)限極(中國(guó))有限公司，江門 529156]

目的 建立香菇多糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法 采用水提醇沉法提取香菇多糖，經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解和PMP柱前衍生后，HPLC 法測(cè)定香菇多糖的單糖組成。結(jié)果 在所建立的指紋圖譜中，共標(biāo)示出13個(gè)特征共有峰，鑒別主要色譜峰6個(gè)，分別是甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖，其中葡萄糖比例最高，其次是甘露糖、半乳糖及巖藻糖。結(jié)論 該方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可為香菇的質(zhì)量控制提供參考。

香菇多糖；單糖；柱前衍生；色譜法，高效液相；指紋圖譜

香菇為香菇科香菇屬植物[Lentinusedodes(Berk.)sing.]的子實(shí)體，具有扶正補(bǔ)虛、健脾開胃、祛風(fēng)透疹、化痰理氣、解毒、抗癌的功效[1]。香菇的化學(xué)成分包括香菇多糖、香菇嘌呤、核苷酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、維生素、揮發(fā)性成分及一定量的萜類物質(zhì)等[2]。其中香菇多糖是主要有效成分之一，也是研究得較早和較多的多糖之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，香菇多糖具有抗腫瘤[3-4]、調(diào)節(jié)免疫[5-6]、抗氧化[7-8]、保肝[9-10]、降血糖[11]、降血脂[12]、抗病毒[13]等多種功效。多糖的單糖組成測(cè)定是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供基本信息的一項(xiàng)重要內(nèi)容。柱前衍生化高效液相色譜(HPLC)法具有分離度高、操作快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)[14-15]。近年來(lái)，有關(guān)香菇多糖單糖組分的研究有少量報(bào)道[16-17]，但筆者尚未見采用柱前衍生化HPLC法的報(bào)道，故采用此法對(duì)香菇多糖的單糖組成指紋圖譜進(jìn)行研究，旨在進(jìn)一步為香菇化學(xué)成分和質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-20AT(DAD)高效液相色譜儀；T1000型萬(wàn)分之一電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；TYXH-1 漩渦混合器(上海喬躍電子有限公司)；HC-3018 高效離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；TC-15 套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)； ES1220-電爐(三角牌)。

1.2 試劑與材料 單糖對(duì)照品：D-葡萄糖(批號(hào)：110833-201205，含量≥99%)，D-甘露糖(批號(hào)：140651-200602，含量≥99%)，D-半乳糖(批號(hào)：100226-201105，含量≥99%)，D-鹽酸氨基葡萄糖(批號(hào)：140649-200702，含量：100%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。L-鼠李糖(批號(hào)：121029，含量≥98%)，L-巖藻糖(批號(hào)：120927，含量≥98%)，D-葡萄糖醛酸(批號(hào)：121009，≥含量98%)，D-半乳糖醛酸(批號(hào)：121106，含量≥98%)，D-木糖(批號(hào)：121026，含量≥98%)，D-氨基半乳糖(批號(hào)：120927，含量≥99%)，D-核糖(批號(hào)：121012，含量≥98%)，D-阿拉伯糖(批號(hào)：121103，含量≥98%)，均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP，上海晶純生化科技股份有限公司，批號(hào)：A1216009，含量≥99%)，三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120903，含量≥99%)；乙腈(德國(guó) Merk 公司，色譜純)；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)均系廣州化學(xué)試劑廠提供；水為純化水；其他化學(xué)試劑除特殊標(biāo)明外均為分析純。香菇樣品XGS1-XGS6購(gòu)自長(zhǎng)洲菜市場(chǎng)，香菇樣品XGS7-XGS10由無(wú)限極(中國(guó))有限公司提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)魏剛研究員鑒定為香菇科香菇屬植物香菇的子實(shí)體。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[18]色譜條件，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定分離度相對(duì)較好的色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 6.7，體積比15.5：84.5)；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取D-核糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-鹽酸氨基葡萄糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-木糖對(duì)照品適量，精密稱定，加純化水制成單糖混合對(duì)照溶液(單糖濃度約0.45 g·mL-1)。精密吸取單糖混合對(duì)照品溶液100 μL置5 mL安瓿中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液100 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP 100 μL，在70 ℃條件下反應(yīng)60 min，取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液200 μL，渦旋混勻，加水至1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，渦旋混勻。加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復(fù)3次，至三氯甲烷層無(wú)顏色，水層即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 香菇多糖溶液的制備 取本品粉末(50～60 ℃減壓干燥，粉碎，過(guò)孔徑0.425 mm 藥篩)1 g，精密稱定，加入80%乙醇100 mL，超聲處理1 h，取出，濾過(guò)，濾渣重復(fù)超聲處理1次。將濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水100 mL，回流提取2 h，取出，趁熱濾過(guò)，殘?jiān)铀?00 mL，重新加熱回流1 h，趁熱濾過(guò)，用適量熱水洗滌殘?jiān)蜑V器，合并濾液與洗液，濃縮水提液至約10 mL，放冷，5 000 r ·min-1離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。轉(zhuǎn)移至離心管中，精密加入無(wú)水乙醇40 mL(慢加快攪)，置5～10 ℃冰箱中放置12 h，5 000 r ·min-1離心10 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌 2 次，每次10 mL，5 000 r ·min-1離心10 min，再加無(wú)水乙醇洗滌2次，每次10 mL，5 000 r ·min-1離心10 min，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得粗多糖溶液。

2.3.2 香菇多糖的TFA部分酸水解 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下樣品粗多糖溶液500 μL，置5 mL的安瓿中，精密加入0.4 mol·L-1TFA溶液500 μL，封口后置110 ℃條件下水解6 h，取出，放冷，水浴蒸干，加入甲醇1 mL攪拌，蒸干以去除TFA，如此重復(fù)至少3次，殘?jiān)訜崴芙?，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得香菇粗多糖水解溶液。

2.3.3 PMP衍生化 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的粗多糖水解溶液 200 μL置5 mL安瓶中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液200 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP溶液 200 μL，在70 ℃條件下反應(yīng)60 min。取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液 400 μL，渦旋混勻。移至5 mL離心管中，加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復(fù)3次，至三氯甲烷層無(wú)顏色，水層即得供試品溶液，用孔徑0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC進(jìn)樣分析。

2.3.4 TFA酸水解時(shí)間的篩選 按“2.3.2”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，水解時(shí)間分別考察1，2，4，6，8 h，所得粗多糖水解溶液按“2.3.3”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，衍生時(shí)間為60 min。精密吸取供試品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以供試品溶液所得 HPLC 圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標(biāo)，反應(yīng)6 h時(shí)共有峰面積和達(dá)到最大，進(jìn)一步篩選水解時(shí)間4，5，6，7，8 h，結(jié)果見圖1，可見隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，主要共有特征峰的峰面積之和隨之升高，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)6 h，水解完全，該點(diǎn)后峰面積和曲線開始下降，因此，確定水解時(shí)間為6 h。

2.3.5 PMP 衍生時(shí)間的篩選 按“2.3.2”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，取水解時(shí)間為6 h所得的粗多糖水解溶液按“2.3.3”項(xiàng)下方法實(shí)驗(yàn)，衍生時(shí)間分別考察60，80，100，120及140 min，精密吸取所得供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以所得 HPLC 圖譜主要共有特征峰的峰面積之和作為衡量指標(biāo)，在所選時(shí)間范圍內(nèi)峰面積之和變化不明顯，說(shuō)明衍生反應(yīng)60 min已基本完全。進(jìn)一步篩選衍生反應(yīng)時(shí)間20，40，60，80，100 min，結(jié)果見圖2，可見隨著衍生反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，主要共有特征峰的峰面積之和隨之升高，衍生反應(yīng)時(shí)間為60 min，多糖趨于反應(yīng)完全，峰面積達(dá)到最大，當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間超過(guò)60 min，曲線下降，因此，確定衍生反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖1 不同水解時(shí)間對(duì)香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜共有峰面積之和的影響

Fig.1 Effect of different hydrolysis time on the sum of common peak area PMP-HPLC fingerprint for mushroom polysaccharides

圖2 不同衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)香菇多糖PMP-HPLC指紋圖譜共有峰面積和的影響

Fig.2 Effect of different derivative time on the sum of common peak area PMP-HPLC fingerprint for mushroom polysaccharides

2.3.6 供試品溶液制備方法的確定 精密吸收“2.3.1”項(xiàng)中樣品粗多糖溶液500 μL，置5 mL安瓶中，精密加入0.4 mol·L-1TFA 溶液500 μL，封口后置110 ℃條件下水解6 h，取出，放冷，水浴蒸干，殘?jiān)尤爰状? mL攪拌，蒸干以去除 TFA，如此重復(fù)至少3次，殘?jiān)訜崴芙猓D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得粗多糖水解溶液。精密吸取粗多糖水解溶液200 μL置5 mL安瓶中，精密加入0.6 mol·L-1氫氧化鈉溶液200 μL，混勻，精密加入0.5 mol·L-1PMP 200 μL，在70 ℃條件下衍生反應(yīng)60 min。取出，放冷，精密加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液400 μL，渦旋混勻。移至5 mL離心管中，渦旋混勻。加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，3 000 r ·min-1離心10 min，棄去三氯甲烷層，如此至少重復(fù)3次，至三氯甲烷層無(wú)顏色，水層即得供試品溶液。

精密吸取與多糖水解溶液等量的水200 μL，按供試品溶液制備方法同法進(jìn)行衍生處理，得溶劑空白對(duì)照。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取衍生化后的同一批供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<3%，相對(duì)峰面積RSD<5%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取衍生化后的同一批供試品溶液，分別在0，2，4，6，10，24 h進(jìn)樣檢測(cè)，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<3%，相對(duì)峰面積RSD<5%，表明供試品溶液在考察的時(shí)間范圍24 h內(nèi)具有較良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，精密稱定，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)，考察各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<3%，相對(duì)峰面積RSD<5 %，表明重復(fù)性良好。

2.5 樣品測(cè)定 按照“2.3”項(xiàng)方法制備10批樣品的供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 混合單糖對(duì)照品分析 精密吸取“2.2”項(xiàng)中混合單糖對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析得到色譜圖(圖3)，混合單糖對(duì)照品除氨基葡萄糖、核糖重疊外，其他9個(gè)成分能獲得較好的分離效果。

2.6.2 共有峰的確定及參照峰的選擇 按“2.3.6”項(xiàng)下制備10批樣品的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件各進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果不同批次樣品均具有基本一致的特征峰，共標(biāo)示出13個(gè)共有峰。經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間定位及色譜峰紫外光譜分析，鑒別6個(gè)色譜峰，即3號(hào)峰(甘露糖)、9號(hào)峰(葡萄糖醛酸)、10號(hào)峰(葡萄糖)、11號(hào)峰(半乳糖)、12號(hào)峰(木糖)、13號(hào)峰(巖藻糖)。以峰11(半乳糖)為參照峰(S)分別計(jì)算各特征共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表1，2。

1.甘露糖；2.氨基葡萄糖、核糖(重疊)；3.鼠李糖；4.葡萄糖醛酸；5.半乳糖醛酸；6.葡萄糖；7.半乳糖；8.木糖；9.阿拉伯糖；10.巖藻糖

圖3 混合對(duì)照HPLC色譜圖

1.mannose；2.amino glucose，ribose(overlapping)；3.isodulcite；4.glucuronic acid； 5.galacturonic acid glucose galactose；6.glucose；7.galactose；8.xylose；9.Arabia sugar；10.fucose

Fig.3 HPLC chromatogram of mixed control

2.6.3 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，以均值法生成指紋圖譜共有模式，衍生試劑空白峰、10批樣品重疊圖及對(duì)照?qǐng)D譜見圖4～6。以共有模式為對(duì)照分析樣品相似度，結(jié)果見表3，提示樣品多糖組成較穩(wěn)定。

3 討論

3.1 香菇多糖提取方法的考察 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香菇在水提過(guò)程中有較多泡沫，且易出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象。采用80%乙醇超聲處理2次除雜質(zhì)，同時(shí)在水提過(guò)程中應(yīng)注意加入沸石并用較大的圓底燒瓶進(jìn)行提取，以利于提取的順利進(jìn)行。香菇中多糖含量較高，采用水提取2次，以提取完全，并經(jīng)過(guò)篩選。

3.2 香菇多糖水解衍生條件的考察 本研究選擇TFA和PMP濃度分別為0.4 和0.5 mol·L-1[18]，并進(jìn)行了不同水解時(shí)間和衍生時(shí)間的篩選。以共有峰面積和作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最優(yōu)的水解時(shí)間和衍生時(shí)間分別為6 h和60 min。

表1 10批香菇多糖共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批香菇多糖共有峰相對(duì)峰面積

圖4 衍生試劑HPLC圖譜

圖5 10批香菇多糖樣品 HPLC 指紋圖譜重疊圖

Fig.5 HPLC overlapping fingerprint of ten batches of mushroom polysaccharides samples

1，2，4，5，6，7，8.待定；3.甘露糖；9.葡萄糖醛酸；10.葡萄糖；11.半乳糖；12.木糖；13.巖藻糖

圖6 香菇多糖樣品 HPLC 指紋圖譜共有模式

1，2，4，5，6，7，8.undetermined；3.mannose；9.glucuronic acid；10.glucose；11.galactose;12.xylose；13.fucose

Fig.6 Common pattern of HPLC fingerprint of mushroom polysaccharides

3.3 樣品指紋圖譜分析 本研究采用酸水解柱前衍生HPLC法測(cè)定香菇多糖的單糖組成，共標(biāo)示出13個(gè)特征峰，鑒別了6個(gè)色譜峰。從糖組成上可以看出，香菇多糖中葡萄糖的比例最大，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]，其次是甘露糖、半乳糖及巖藻糖等，而其他色譜峰的峰面積相對(duì)較低。10批供試品相似度>0.99，表明香菇多糖PMP柱前衍生HPLC指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性，可作為香菇質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)的參考依據(jù)之一。

表3 香菇多糖HPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.022

HPLC Fingerprint of Mushroom Polysaccharides by Pre-column Derivatization

CHEN Zhihui1，TAN Lirong2，LUO Ming1，HUANG Qimin2，ZHANG Meiling2，WEI Gang1

(1.GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou510006，China；2.Infinitus(China)CompanyLimited，Jiangmen529156,China)

Objective To establish the chromatographic fingerprint of mushroom polysaccharides by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) pre-column derivatization. Methods The mushroom polysaccharides was extracted by hot distilled water, precipitated by alcohol, and hydrolyzed into monosaccharides by Trifluoroacetic Acid (TFA).The hydrolysate was derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) and tested via HPLC to study the monosaccharide components in mushroom polysaccharides. Results Fingerprint was established with 13 common peaks, 6 peaks in which were identified as mannose,D-glucuronic acid,D-glucose, galactose, xylose andL-fucose.The glucose accounted for the most, followed by mannose, galactose and fucose. Conclusion Development of fingerprint chromatogram by HPLC is a stable, simple, and repeatable way, which can be applied to the quality control of mushroom polysaccharides.

Mushroom polysaccharides; Monosaccharide; Pre-column derivatization; Chromatography, high performance liquid; Fingerprint chromatogram

2014-07-08

2014-08-25

*廣東省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B090600025)

陳志輝(1987-)，女，湖南長(zhǎng)沙人，碩士，從事創(chuàng)新中藥研究與指紋圖譜分析工作。電話：(0)13824448792，E-mail：czh198710@163.com。

魏剛(1969-)，男，四川內(nèi)江人，研究員，博士生導(dǎo)師，碩士，從事創(chuàng)新中藥研究與指紋圖譜分析工作。電話：020-39358519，E-mail：weigang021@163.com。

R282.71；R284

B

1004-0781(2015)05-0649-06