何國(guó)榮，成銀霞，穆鑫，王月華，孫嵐，方蓮花，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所“藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

·中藥與天然藥物專欄·

木犀草素和蘆丁組合物對(duì)帕金森病模型小鼠的防治作用*

何國(guó)榮，成銀霞，穆鑫，王月華，孫嵐，方蓮花，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所“藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

目的 探討木犀草素和蘆丁組合物(MLR)對(duì)帕金森病(PD)模型小鼠的治療作用及其機(jī)制。方法 C57BL/6 小鼠72只，隨機(jī)分為 6組(n=12)，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，美多巴組(50 mg·kg-1)和MLR小、中、大劑量組(140，280，560 mg·kg-1)。小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)30 mg·kg-1，建立亞急性 PD模型。采用爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和體力；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠 MPTP 損傷通路中酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)；高效液相色譜法檢測(cè)中腦神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量。結(jié)果 MLR 可顯著改善PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力(P<0.01或P<0.05)。MLR (280和560 mg·kg-1)可增加 TH 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(可分別達(dá)到正常對(duì)照組的69.00%和77.95%，P<0.01)和 DAT 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(可分別達(dá)到正常對(duì)照組的68.53%和70.40%，P<0.05)，顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性(P<0.01)。MLR 各劑量組腦內(nèi)單胺遞質(zhì)紊亂均顯著改善。結(jié)論 MLR 可顯著改善 MPTP 致小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力損傷，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)遞質(zhì)水平、抑制炎性反應(yīng)、減輕神經(jīng)元損傷發(fā)揮治療 PD 的作用。

木犀草素；蘆丁；帕金森病；神經(jīng)遞質(zhì)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)已成為世界上第二大常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，尚無(wú)根治方法，部分患者迅速發(fā)展致殘，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前PD 的發(fā)病原因及機(jī)制尚不清楚，但與遺傳因素、環(huán)境毒素、氧化應(yīng)激、興奮性毒性、細(xì)胞凋亡、線粒體功能異常等多種因素有關(guān)[1]，自由基氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)雖然不能完全解釋PD 發(fā)病的原因，但與PD 有著密切關(guān)系。

20世紀(jì)60年代以來(lái)，PD 的治療以糾正中樞多巴胺(dopamine，DA)和乙酰膽堿水平的失衡為主[2]。這些治療措施可以有效控制疾病癥狀，提高患者生活質(zhì)量，但不能從根本上逆轉(zhuǎn)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)的變性，而且長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)或不同程度的藥效減退。因此，療效確切、不良反應(yīng)小的藥物將會(huì)有廣闊的市場(chǎng)前景。

筆者[3]早期研究發(fā)現(xiàn)，天然黃酮類化合物木犀草素和蘆丁組合物(mixture of luteolin and rutin，MLR)，能夠劑量依賴性地減輕6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，抑制PD模型大鼠的震顫行為，減輕DA 能神經(jīng)元損傷和炎性因子的生成、釋放等。

用于PD 研究的各種小鼠模型中，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridin，MPTP )所致的PD 小鼠模型在神經(jīng)化學(xué)、行為學(xué)表現(xiàn)和組織病理學(xué)變化與PD 患者的病理表現(xiàn)類似，是應(yīng)用較廣泛的模型[4]。筆者使用MPTP 制備PD 小鼠模型，觀察MLR 改善動(dòng)物肢體協(xié)調(diào)能力、調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡、恢復(fù)DA 能神經(jīng)元功能等方面的抗PD 作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 C57BL/6 小鼠72只，♂，7～8 周齡，體質(zhì)量18～ 22 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK(京)2004-0001。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2004-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度(22±1) ℃、相對(duì)濕度55%～ 65%、12 h光照周期的通風(fēng)干燥環(huán)境中，采用大小鼠維持料1022 飼養(yǎng)。

1.2 試劑與樣品 MLR(美國(guó)SYNORx，Inc.生產(chǎn)，批號(hào)：s062107，含木犀草素和蘆丁各50%)。美多巴片(上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：SH 0502)。MPTP、DA、二羥基苯乙酸(dioxyphenylacetic acid，DOPAC)、高香草酸(homovanilic acid，HVA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT ) 和 5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)均購(gòu)自Sigma-aldrich 公司；酪氨酸羥化酶(trysine hydroxylase，TH)抗體購(gòu)自Chemicon 公司；多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)、膠質(zhì)源性纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司；卵白素-生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(avidin biotin-peroxidase complex，ABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)裝置(XPS-2，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)裝置(自制)，冰凍切片機(jī)(SM900，美國(guó) Leica 公司)，高速低溫離心機(jī)(5810R，美國(guó) Eppendorf 公司)，熒光顯微鏡(X71，日本OLYPUS 公司)，高效液相色譜庫(kù)侖電化學(xué)分析系統(tǒng)(HPLC-ECD Coulchem Ⅲ，ESA，美國(guó))。

1.4 小鼠分組及模型制備 C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為 6 組，每組 12 只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、美多巴組(50 mg·kg-1)和MLR 小劑量(140 mg·kg-1)組、MLR中劑量(280 mg·kg-1)組、MLR大劑量(560 mg·kg-1)組。適應(yīng)環(huán)境1周后，連續(xù)灌胃給藥 7 d，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組小鼠灌胃給予純化水；第 8 天開(kāi)始，于每天灌胃給藥 45 min 后除正常對(duì)照組給予等體積0.9% 氯化鈉溶液外，其余各組均腹腔注射MPTP(30 mg·kg-1)，連續(xù) 5 d。在每次注射MPTP 后立即觀察小鼠的各種急性表現(xiàn)，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.5 爬桿實(shí)驗(yàn) 采用XPS-2小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)裝置，引導(dǎo)小鼠從桿頂爬到桿底，每只訓(xùn)練4次，記錄小鼠爬到桿底所需要的時(shí)間，超過(guò)60 s 的以60 s 計(jì)。在末次腹腔注射MPTP 后1 h ，再次測(cè)定其爬桿時(shí)間，每只小鼠測(cè)3次取平均值。衡量小鼠因MPTP 引起肢體協(xié)調(diào)能力下降程度。

1.6 懸掛實(shí)驗(yàn) 將受試小鼠兩前爪懸掛于一根水平金屬線上(直徑1 mm，距地面30 cm)停留10 s，每天2次。于小鼠末次腹腔注射MPTP 后 1.5 h 進(jìn)行測(cè)試。小鼠懸掛能力評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：在前10 s內(nèi)，小鼠用2個(gè)后爪抓住金屬線記3分，用1個(gè)后爪抓住金屬線記2分，2個(gè)后爪均抓不住金屬線記1分，最后計(jì)算得分情況并記錄小鼠從金屬線上掉下的時(shí)間，超過(guò)60 s 以60 s 計(jì)。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 每組取 5 只小鼠，10% 水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，開(kāi)胸主動(dòng)脈插管，灌注0.9% 氯化鈉溶液200 mL 至流出液澄清，換用4% 多聚甲醛溶液(0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液配制，pH7.2～7.4)繼續(xù)灌注約200 mL，至大鼠全身僵硬，肝臟發(fā)白為止。灌注結(jié)束后室溫放置30 min，取腦置上述固定液中繼續(xù)固定24 h，換用含30% 蔗糖的4%多聚甲醛溶液，組織下沉后再次更換蔗糖多聚甲醛溶液，4 ℃ 保存。

取大鼠腦作連續(xù)冠狀切片，片厚20 μm。切片與一抗稀釋液(TH，1：500；DAT，1：200；GFAP，1：400)4 ℃ 孵育過(guò)夜；然后分別與生物素標(biāo)記的二抗(1：300)反應(yīng)1 h以及ABC反應(yīng)2 h，最后用含有DAB的緩沖液呈色。神經(jīng)元計(jì)數(shù)方法：隨機(jī)選取每只小鼠腦切片3 張，分別在左側(cè)和右側(cè)黑質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞密集區(qū)中央部分取4 個(gè)互不重疊的高倍視野，累計(jì)左側(cè)和右側(cè)黑質(zhì)的免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目并計(jì)算其均數(shù)。

1.8 紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定 末次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取 5 只小鼠斷頭取腦，冰上快速分離出紋狀體，迅速置于液氮中冷凍固化，稱質(zhì)量。紋狀體組織加入勻漿液200 μL，經(jīng)超聲破碎(200 W，50 s)，12 000 r·min-1、4 ℃離心30 min，取上清液，使用孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)后直接注入HPLC-ECD 系統(tǒng)檢測(cè)分析。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)應(yīng)用反相HPLC-ECD 測(cè)定，色譜柱：CAPCELL PAK C18MG (3 mm×75 mm，3 μm)。流動(dòng)相(pH 3.25)由0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉(NaH2-PO4)溶液、0.85 mmol·L-1辛基硫酸鈉(octyl-sulfate sodium salt，OSA)、0.5 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)和 11%甲醇組成，流速1.0 mL·min-1。電化學(xué)檢測(cè)工作電壓150 mV，檢測(cè)溫度為35 ℃。

2 結(jié)果

2.2 MLR對(duì)PD模型小鼠懸掛行為的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的懸掛能力明顯降低，表現(xiàn)為懸掛評(píng)分顯著下降(P<0.01)，懸掛時(shí)間明顯縮短(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MLR中、大劑量組懸掛評(píng)分顯著提高(P<0.05)，MLR中、大劑量組懸掛時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)(圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 MLR對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)TH表達(dá)的影響 正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元大量表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)染色較深，呈棕黃色，可見(jiàn)免疫陽(yáng)性突起。模型對(duì)照組TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)明顯減少(P<0.01)，是正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的32.64%。 MLR 中、大劑量組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P<0.01)，分別為正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的69.00% 和77.95%(圖3)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=2.899 ，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=2.933，*2P<0.01，t=2.826，*3P<0.05，t=2.892，*4P<0.01，t=3.668，*5P<0.01

圖1 6組小鼠爬竿時(shí)間比較

A.normal control group；B.model control group; C.madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F. high -dose MLR group；Compared with normal control group，t=2.899，*1P<0.01; compared with model control group，t=2.933，*2P<0.01，t=2.826，*3P<0.05，t=2.892，*4P<0.01，t=3.668，*5P<0.01

Fig.1 Comparison of climbing pole time among six groups of mice

2.3.2 MLR對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)DAT表達(dá)的影響 DAT主要位于神經(jīng)元軸突和末梢的質(zhì)膜上，能夠反映黑質(zhì)-紋狀體通路DA 能神經(jīng)元的數(shù)量及功能。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組DAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目顯著減少(P<0.01)，是正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)DAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的47.45%。采用美多巴和MLR 中、大劑量治療后，DAT 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均明顯增加(均P<0.05)，分別是正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)DAT 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的66.50%，68.53%和70.40%(圖4)。

2.3.3 MLR對(duì)PD模型小鼠黑質(zhì)GFAP表達(dá)的影響 腹腔注射MPTP連續(xù)5 d后，模型對(duì)照組小鼠黑質(zhì)可見(jiàn)大量散在分布的GFAP 免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，是正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的265.34%(P<0.01)。采用美多巴和MLR預(yù)處理可顯著降低GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目(P<0.01)，黑質(zhì)GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)分別是模型對(duì)照組的82.42%，82.06%，69.64%，73.17%(圖5)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=5.014，*1P<0.01，t=3.062，*4P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=2.803，*2P<0.05，t=2.803，*3P<0.05，t=2.255，*5P<0.05，t=3.062，*6P<0.01

圖2 6組小鼠懸掛評(píng)分和懸掛時(shí)間比較

A.normal control group；B.model control group; C.madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high-dose MLR group；Compared with normal control group，t=5.014，*1P<0.01，t=3.062，*4P<0.01；compared with model control group，t=2.803，*2P<0.05，t=2.803，*3P<0.05，t=2.255，*5P<0.05，t=3.062，*6P<0.01

Fig.2 Comparison of traction score and time among six groups of mice

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=6.298，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=3.264，*2P<0.01，t=3.137，*3P<0.01

圖3 6組小鼠黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較

A.normal control group；B.model control group; C.Madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high -dose MLR group；Compared with normal control group，t=6.298，*1P<0.01; compared with model control group，t=3.264，*2P<0.01，t=3.137，*3P<0.01

Fig.3 Comparison of numbers of immunostain-positive TH in substantia nigra among six groups of mice

2.4 MLR對(duì)PD模型小鼠紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

2.4.1 MLR對(duì)PD模型小鼠紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物水平的影響 腹腔注射MPTP連續(xù)5 d后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠紋狀體中的DA 及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA 含量均顯著下降(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，用MLR 治療后，中、小劑量組DA有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，大劑量組DA、 HVA 含量顯著增加(P<0.05或P<0.01)，DOPAC 的含量均無(wú)明顯變化(圖6)。

2.4.2 MLR對(duì)PD模型小鼠紋狀體5-HT及其代謝產(chǎn)物水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠紋狀體中的5-HT 含量顯著下降(P<0.05)，5-HIAA 的含量則沒(méi)有顯著變化。MLR 治療后，紋狀體中5-HT、5-HIAA的含量顯著增加(P<0.05或P<0.01)，但陽(yáng)性藥美多巴則對(duì)MPTP造成的5-HT代謝紊亂沒(méi)有明顯影響(圖7)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=4.712，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=2.418，*2P<0.05，t=2.718，*3P<0.05，t=2.566，*4P<0.05

圖4 6組小鼠黑質(zhì)DAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較

A.normal control group；B.model control group; C.Madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high -dose MLR group；Compared with normal control group，t=4.712，*1P<0.01; compared with model control group，t=2.418，*2P<0.05，t=2.718，*3P<0.05，t=2.566，*4P<0.05

Fig.4 Comparison of numbers of immunostain-positive DAT in substantia nigra among six groups of mice

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=10.860，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=3.361，*2P<0.01，t=3.309，*3P<0.01，t=4.602，*4P<0.01,t=4.570，*5P<0.01

圖5 6組小鼠黑質(zhì)GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較

A.normal control group；B.model control group; C.madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high -dose MLR group；Compared with normal control group，t=10.860，*1P<0.01; compared with model conrol group，t=3.361，*2P<0.01，t=3.309，*3P<0.01，t=4.602，*4P<0.01,t=4.570，*5P<0.01

Fig.5 Comparison of astrocyte numbers of immunostain-positive GFAP in substantia nigra among six groups of mice

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=11.519，*1P<0.01，t=12.198，*4P<0.01，t=5.884，*6P<0.01；與模型對(duì)照組比較，t=6.103，*2P<0.01，t=2.582，*3P<0.05，t=10.502，*5P<0.01，t=7.080，*7P<0.01，t=3.201，*8P<0.01，t=3.754，*9P<0.01，t=5.452，*10P<0.01

圖6 6組小鼠紋狀體內(nèi)DA 、DOPAC 和 HVA含量比較

A.normal control group；B.model control group; C.madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high -dose MLR group；Compared with normal control group，t=11.519，*1P<0.01，t=12.198，*4P<0.01，t=5.884，*6P<0.01; compared with model control group，t=6.103，*2P<0.01，t=2.582，*3P<0.05，t=10.502，*5P<0.01，t=7.080，*7P<0.01，t=3.201，*8P<0.01，t=3.754，*9P<0.01，t=5.452，*10P<0.01

Fig.6 Comparison of the contents of DA，DOPAC and HVA in striatum of six groups of mice

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.美多巴組；D.MLR 小劑量組；E.MLR中劑量組；F.MLR大劑量組；與正常對(duì)照組比較，t=3.094，*1P<0.05；與模型對(duì)照組比較，t=3.729，*2P<0.01，t=4.516，*3P<0.01，t=5.381，*4P<0.01，t=3.291，*5P<0.05，t=4.706，*6P<0.01，t=4.158，*7P<0.01

圖7 6組小鼠紋狀體內(nèi)5-HT和5-HIAA含量比較

A.normal control group；B.model control group; C.madopa group; D.low-dose MLR group；E.middle-dose MLR group；F.high-dose MLR group；Compared with normal control group，t=3.094，*1P<0.01; compared with model control group，t=3.729，*2P<0.01，t=4.516，*3P<0.01，t=5.381，*4P<0.01，t=3.291，*5P<0.05，t=4.706，*6P<0.01，t=4.158，*7P<0.01

Fig.7 Comparison of the contents of 5-HT and 5-HIAA in striatum of six groups of mice

3 討論

MPTP是制備PD 模型的常用工具藥，不同的給藥方法和劑量導(dǎo)致的動(dòng)物行為學(xué)變化也有不同[5- 6]。本實(shí)驗(yàn)采用亞急性多次給藥方法，模型動(dòng)物出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力障礙。對(duì)于PD患者，除了靜止性震顫外，肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低以姿勢(shì)平衡障礙為主要特征，因此，對(duì)協(xié)調(diào)能力的改善是考察藥物有效性的重要標(biāo)準(zhǔn)[7]。筆者應(yīng)用爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，并以爬桿時(shí)間、懸掛能力評(píng)分和懸掛時(shí)間作為衡量指標(biāo)。結(jié)果顯示，MPTP 損傷后，模型對(duì)照組爬桿時(shí)間顯著延長(zhǎng)、懸掛能力評(píng)分明顯降低、懸掛時(shí)間明顯縮短，表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力嚴(yán)重受損。給予MLR治療后，小鼠爬桿時(shí)間和懸掛時(shí)間顯著縮短。

星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活和增生與神經(jīng)元變性死亡密切相關(guān)[8-10]。本研究結(jié)果表明，模型對(duì)照組GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞胞體較正常對(duì)照組的星形膠質(zhì)細(xì)胞大，突起增多，顏色加深，免疫反應(yīng)呈中強(qiáng)陽(yáng)性，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致[11]，MLR 各給藥組均顯示出抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和增生的作用。

MLR可劑量依賴性抑制TH 神經(jīng)元的丟失，具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用；MLR 預(yù)防給藥可降低MPTP 的神經(jīng)毒性，調(diào)節(jié)GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞與TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞比例，與調(diào)節(jié)DA能神經(jīng)元死亡有一定關(guān)系[12]。黑質(zhì)紋狀體中DAT的mRNA 水平和蛋白水平的降低與病程有密切關(guān)系[13-14]。本研究結(jié)果顯示，美多巴和MLR預(yù)防治療可不同程度增加DAT 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量。

PD最顯著的生物化學(xué)特征是腦內(nèi)DA 含量減少，其含量與黑質(zhì)致密區(qū)DA 能神經(jīng)元的喪失密切相關(guān)[15]。本研究表明，MPTP 損傷后，模型對(duì)照組小鼠紋狀體中的DA 含量明顯降低，這是出現(xiàn)PD 癥狀主要原因。HVA 反映 DA 轉(zhuǎn)化總量，MPTP 損傷后HVA 的水平明顯下降，但下降的幅度不如DA，因此HVA/DA的比值增加，這與以往報(bào)道相一致[15]。MLR 治療后HVA/DA 比值明顯下降，提示MLR 可能會(huì)通過(guò)降低DA 的轉(zhuǎn)化率來(lái)發(fā)揮作用。黑質(zhì)-紋狀體通路中5-HT 含量豐富，是與PD密切相關(guān)的遞質(zhì)之一，5-HT 能神經(jīng)元功能與也與PD密切相關(guān)[16]。MLR 治療可顯著增加5-HT 的含量，提示MLR 對(duì)PD 非運(yùn)動(dòng)功能障礙也具有一定防治效果。

綜上所述，MLR 通過(guò)提高DA 和5-HT 水平、抑制MPTP 造成的DA 和5-HT 過(guò)度代謝及轉(zhuǎn)化、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和增生、保護(hù)DA 能神經(jīng)元發(fā)揮對(duì)PD 模型小鼠的治療作用，改善動(dòng)物肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，提示MLR 具有臨床治療PD 應(yīng)用前景。

志謝：感謝Thomas P.Lahey先生和SYNORx，Inc公司提供實(shí)驗(yàn)樣品及在研究過(guò)程中給予的幫助。

[1] COLLINS L M，TOULOUSE A，CONNOR T J，et al.Con-tributions of central and systemic inflammation to the pathophysiology of Parkinson's disease[J].Neurophar-macology，2012，62 (7)：2154-2168.

[2] BOVE J，PERIER C.Neurotoxin-based models of Parkin-son's disease[J].Neuroscience，2012，211(1)：51-76.

[3] 何國(guó)榮，成銀霞，穆鑫，等.木犀草素聯(lián)合蘆丁抗6-羥多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病大鼠震顫及神經(jīng)保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(5)：626-632.

[4] 馬曉偉，李曉麗，張忠霞，等.1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶的神經(jīng)毒性與帕金森病[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33(12)：6350-6353.

[5] 顏凡莉，陳明蒼，季宇彬.帕金森模型及評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10(6)：55-57.

[6] 都艷玲，陳孛玉，張榮懷，等.小鼠帕金森病模型的行為學(xué)及組織病理學(xué)改變的觀察分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13(15)：2865-2869.

[7] REKHA K R，SELVAKUMAR G P，SETHUPATHY S，et al.Geraniol ameliorates the motor behavior and neurotrophic factors inadequacy in MPTP-induced mice model of Parkinson's disease[J].J Mol Neurosci，2013，51 (3)：851-862.

[8] MARCHETTI B，L'EPISCOPO F，MORALE M C，et al.Un-covering novel actors in astrocyte-neuron crosstalk in Parkinson's disease：the Wnt/β-catenin signaling cascade as the common final pathway for neuroprotection and self-repair[J].Eur J Neurosci，2013，37 (10)：1550-1563.

[9] ZHOU J，QU X D，LI Z Y，et al.Salvianolic acid B atte-nuates toxin-induced neuronal damage via Nrf2-dependent glial cells-mediated protective activity in Parkinson's disease models[J].PLoS One，2014，9 (7)：e101668.

[10] MATTSON M P.Parkinson's disease：don't mess with calc-ium[J].J Clin Invest，2012，122 (4)：1195-1198.

[11] L'EPISCOPO F，TIROLO C，TESTA N，et al.Plasticity of subventricular zone neuroprogenitors in MPTP (1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine) mouse model of Parkinson's disease involves cross talk between inflamma-tory and Wnt/β-catenin signaling pathways：functional consequences for neuroprotection and repair[J].J Neurosci，2012 ，32 (6)：2062-2085.

[12] ZAITONE S A，HAMMAD L N，F(xiàn)ARAG N E.Antioxidant potential of melatonin enhances the response to L-dopa in 1-methyl 4-phenyl 1，2，3，6-tetrahydropyridine-parkinsonian mice[J].Pharmacol Rep，2013，65 (5)：1213-1226.

[13]SONSALLA P K，COLEMAN C，WONG L Y，et al.The angio-tensin converting enzyme inhibitor captopril protects nigrostriatal dopamine neurons in animal models of parkinsonism[J].Exp Neurol，2013，250(2)：376-383.

[14] KHAN M M，KEMPURAJ D，THANGAVEL R，et al.Protec-tion of MPTP-induced neuroinflammation and neurodegeneration by pycnogenol[J].Neurochem Int，2013，62 (4)：379-388.

[15]STERKY F H，HOFFMAN A F，MILENKOVIC D，et al.Altered dopamine metabolism and increased vulnerability to MPTP in mice with partial deficiency of mitochondrial complex I in dopamine neurons[J].Hum Mol Genet，2012，21 (5)：1078-1089.

[16]ANSAH T A，F(xiàn)ERGUSON M C，NAYYAR T，et al.Age- and duration-dependent effects of MPTP on cortical serotonin systems[J].Neurosci Lett，2011，504 (2)：160-164.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.004

Therapeutic Effect of the Mixture of Luteolin and Rutin in MPTP Induced Mouse Model of Parkinson's Disease

HE Guorong, CHENG Yinxia, MU Xin, WANG Yuehua, SUN Lan, FANG Lianhua, DU Guanhua

(BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetsIdentificationandDrugScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Objective To study the therapeutic effect of the complex mixture of luteolin and rutin (MLR) on 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) induced Parkinson’s disease (PD) mouse model. Methods Seventy-two C57BL/6 mice were divided into six groups randomly (n=12 in each group): the normal control , model control , madopar (50 mg·kg-1) group, MLR at low (140 mg·kg-1), middle (280 mg·kg-1) and high (560 mg·kg-1) dose groups. PD mouse models were established by intraperitoneal injection of MPTP (30 mg·kg-1).Pole test and traction performance were recorded to access the body coordinate capability and strength. The tyrosine hydroxylase (TH), dopamine transport protein (DAT), and glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive cells were detected by immunohistochemical method. Dopamine (DA), dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanilic acid (HVA), 5-hydroxytryptamine (5-HT) and 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) in striatum were quantified by HPLC-ECD. Results MLR significantly ameliorated mouse motor coordination ability (P<0.01 orP<0.05). MLR at 280 and 560 mg·kg-1could increase TH-positive neurons by 69.00% and 77.95% compared with the normal control group (P<0.01) and DAT-positive neurons by 68.53% and 70.40% compared with the normal control group(P<0.05), and decrease GFAP-postive astrocyte reactivity. The treatment with MLR at three doses attenuated the monoamine neurotransmitter disorder. Conclusion MLR markedly improves MPTP caused movement coordinate disability in mice and exerts therapeutic action on PD by regulating neurotransmitters in brain, inhibiting the inflammatory reaction and alleviating the neuron injury.

Luteolin; Rutin; Parkinson’s disease; Neurotransmitters

2015-01-19

2015-03-03

*國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“十二五”課題(2013ZX09102106，2013ZX09508104，2012ZX09103-101-078)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473383)

何國(guó)榮(1974-)，女，山西太原人，助理研究員，博士，從事新藥發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)藥理學(xué)研究。電話：010-63165184，E-mail：hegr@imm.ac.cn。

杜冠華(1956-)，男，山東滕州人，研究員，博士生導(dǎo)師，博士，從事新藥發(fā)現(xiàn)、高通量藥物篩選、神經(jīng)藥理學(xué)和心腦血管藥理學(xué)研究。電話：010-63165184，E-mail：dugh@imm.ac.cn。

R286；R971

A

1004-0781(2015)05-0578-07