程昕昕， 牛永勝， 劉 正

(安徽科技學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100)

2個(gè)Sh2甜玉米自交系種子萌發(fā)過程中關(guān)鍵水解酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析

程昕昕①， 牛永勝， 劉 正

(安徽科技學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100)

為闡明Sh2甜玉米(Zeamayssubsp.saccharataSturt.)種子萌發(fā)過程中關(guān)鍵水解酶對(duì)種子貯藏物質(zhì)利用的作用，以Sh2甜玉米自交系BF109和Q267的種子為材料，對(duì)種子萌發(fā)2、4、6、8和10 d時(shí)貯藏物質(zhì)的消耗量和利用率以及總淀粉酶和蔗糖合成酶的活性進(jìn)行了測(cè)定，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)9個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：種子萌發(fā)6 d時(shí)2個(gè)自交系的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量大幅度提高，說明種子內(nèi)的貯藏物質(zhì)進(jìn)入快速分解階段。隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)自交系的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量逐漸升高，而貯藏物質(zhì)利用率則呈先升高后降低的趨勢(shì)；總體上看，自交系BF109的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量顯著高于自交系Q267(P<0.05)，而其貯藏物質(zhì)利用率則顯著低于后者。隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)自交系種子內(nèi)的總淀粉酶和蔗糖合成酶活性也總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且自交系BF109種子內(nèi)2種酶活性基本上低于或顯著低于自交系Q267。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明：在種子萌發(fā)2～10 d期間，2個(gè)自交系種子中9個(gè)α-淀粉酶和蔗糖合成酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量均有較大差異，但7個(gè)α-淀粉酶相關(guān)基因(包括α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3D和α-Amy3E)的相對(duì)表達(dá)量均在萌發(fā)前期較高，利于合成α-淀粉酶并參與淀粉水解；α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3D和SuSy-2基因的相對(duì)表達(dá)量在種子萌發(fā)2～10 d均較高，而α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3E和SuSy-3基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H在種子萌發(fā)2 d時(shí)較高，說明α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3D和SuSy-2基因可能是Sh2甜玉米種子萌發(fā)過程中的關(guān)鍵水解酶基因?？傮w來看，自交系Q267種子中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于自交系BF109，這可能是導(dǎo)致自交系Q267種子中總淀粉酶和蔗糖合成酶活性及貯藏物質(zhì)利用率較高的主要原因。

Sh2甜玉米； 種子萌發(fā)； 貯藏物質(zhì)利用率； 淀粉酶； 蔗糖合成酶； 基因表達(dá)

甜玉米(Zeamayssubsp.saccharataSturt.)為玉米屬(ZeaLinn.)中因基因突變而產(chǎn)生的1個(gè)亞種，主要包括su1、su2、sh1、sh2、sh4、du、ae、bt1、bt2、se和wx共11個(gè)隱性突變基因，其中sh1、sh2、sh4、bt1和bt2基因突變體的蔗糖向淀粉的轉(zhuǎn)變過程明顯受阻，致使其胚乳的含糖量較高，乳熟期胚乳的可溶性糖含量高達(dá)15%以上，由此也造成甜玉米種子的干物質(zhì)積累不充足，種子皺縮干秕、發(fā)芽率低、拱土能力差，對(duì)其種植和生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。因此，甜玉米生產(chǎn)的首要條件是提高其種子活力，使之擁有較強(qiáng)的種子萌發(fā)和成苗能力。

植物種子萌發(fā)主要包括胚萌動(dòng)和幼苗形成2個(gè)階段[1]。通常，種子在萌發(fā)期間需要的營養(yǎng)和能量主要來自其對(duì)貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用。吸脹后，種子的呼吸作用明顯加強(qiáng)，在淀粉酶和蔗糖合成酶等一系列酶的作用下，淀粉和蛋白質(zhì)等內(nèi)部貯藏物質(zhì)的代謝活動(dòng)逐漸活躍并發(fā)生轉(zhuǎn)變，為幼苗早期生長(zhǎng)提供必需的營養(yǎng)和能量[2-4]。因此，在種子萌發(fā)過程中，幼苗生長(zhǎng)主要受種子貯藏物質(zhì)消耗量和利用率的影響。

淀粉酶和蔗糖合成酶是影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的2個(gè)關(guān)鍵酶。其中，α-淀粉酶(EC3.2.1.1)可將種子中貯藏的淀粉水解為糖類物質(zhì)，為幼根和幼苗形成提供能量[5-7]；蔗糖合成酶(EC2.4.1.13)是種子貯藏物質(zhì)代謝過程中必需的關(guān)鍵酶之一，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是一種可逆酶，其作用就是催化蔗糖和UDP轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖和果糖[8-10]。相關(guān)的研究結(jié)果[6,11-12]表明：α-淀粉酶在種子萌發(fā)過程中合成，并且主要受赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)的調(diào)控。在水稻(OryzasativaLinn.)種子萌發(fā)過程中，α-淀粉酶基因(包括α-Amy1A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3D和α-Amy3E)在不同組織中的表達(dá)具有較大差異[6,13]。蔗糖合成酶是由多基因編碼的酶類，目前在玉米(ZeamaysLinn.)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與籽粒生長(zhǎng)相關(guān)的蔗糖合成酶編碼基因，分別為Sh1、Sus1和Sus3[14]。

為了明確α-淀粉酶和蔗糖合成酶對(duì)甜玉米種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)利用的作用，作者以2個(gè)Sh2甜玉米自交系BF109和Q267的種子為供試材料，對(duì)種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的消耗量和利用率、淀粉酶和蔗糖合成酶活性及9個(gè)相關(guān)基因(包括α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3D、α-Amy3E、SuSy-2和SuSy-3)表達(dá)特性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析和比較，以期為甜玉米優(yōu)良品種的培育研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子均由安徽玉米工程技術(shù)研究中心提供。前者為從美國先鋒種業(yè)引進(jìn)的自交系，百粒質(zhì)量9.08 g；后者是利用二環(huán)系法選育出的自交系，百粒質(zhì)量11.75 g。

實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器有7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、5427R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)和JS-680D電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；淀粉酶和蔗糖合成酶活性檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所研發(fā)，Trizol試劑盒為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品，PrimeScript RT reagent Kit為上海華舜生物公司產(chǎn)品，buffer、dNTPs和TaqDNA聚合酶等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；所有引物合成均交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā) 按照GB/T 3543.1—1995至GB/T 3543.7—1995中的方法進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。將種子用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2溶液消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗3次，每次1 min；用高溫滅菌濾紙吸干表面水分，挑選大小均勻且健康飽滿的種子，置于104 ℃烘箱中處理至種子含水率為13%；將種子置于鋪有3層濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒(長(zhǎng)度30 cm、寬度20 cm)中，每盒50粒種子；每個(gè)自交系15盒，各自分成3組，視為3個(gè)重復(fù)。將發(fā)芽盒置于(25±1) ℃條件下暗培養(yǎng)，每天觀察種子萌發(fā)情況，每2天取1盒萌發(fā)種子進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)和基因表達(dá)量分析。

1.2.2 種子貯藏物質(zhì)消耗量和利用率分析 種子萌發(fā)前，首先稱量50粒已經(jīng)去除剩余13%水分的種子的總質(zhì)量，并計(jì)算單粒種子質(zhì)量，記為種子原始干質(zhì)量(W0)。分別于種子萌發(fā)2、4、6、8和10 d時(shí)各取1個(gè)發(fā)芽盒，將發(fā)芽盒內(nèi)種子萌發(fā)出的幼苗(包括胚根和胚芽)與剩余籽粒分開，分別用錫紙包好并置于104 ℃烘箱中持續(xù)干燥處理24 h后稱量，分別記為單株幼苗干質(zhì)量(W1)和單粒種子剩余干質(zhì)量(W2)。參照Soltani等[15]的方法計(jì)算單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量(W3)和單粒種子貯藏物質(zhì)利用率(R)，計(jì)算公式分別為“W3=W0-W2”和“R=W1/W3”。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 酶活性測(cè)定 采用淀粉酶活性(碘-淀粉比色法)檢測(cè)試劑盒和蔗糖合成酶活性檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定種子萌發(fā)過程中的總淀粉酶和蔗糖合成酶活性。在種子萌發(fā)2、4、6、8和10 d時(shí)分別取樣，清洗并吸干種子表面水分后，稱取1 g種子，加入9 mL總淀粉酶(或蔗糖合成酶)提取劑，于冰浴中研磨成勻漿；4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為總淀粉酶(或蔗糖合成酶)粗提液。按照各自檢測(cè)試劑盒說明書中的操作流程分別測(cè)定種子萌發(fā)過程中總淀粉酶和蔗糖合成酶活性。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 在種子萌發(fā)2、4、6、8和10 d時(shí)分別取樣(其中，萌發(fā)2 d時(shí)取種胚，萌發(fā)4～10 d時(shí)取幼苗)，參照Trizol試劑盒說明書中的操作流程提取種子胚中的總RNA，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度，并用PrimeScript RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以玉米18SrRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參、采用9個(gè)α-淀粉酶和蔗糖合成酶基因的特異引物(引物序列見表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次。

擴(kuò)增反應(yīng)在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包括14.5 μL ddH2O、0.5 μLdNTPs、 正向和反向引物各1.0 μL、 2.5 μL 10×buffer、0.5 μLTaqDNA聚合酶及1.0 μL cDNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存、備用。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 用于Sh2甜玉米9個(gè)α-淀粉酶和蔗糖合成酶基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的特異引物序列

Table 1 Sequence of special primers used for real-time fluorescence quantitative PCR amplification of nine genes ofα-amylase and sucrose synthase ofSh2 sweet corn

基因名稱Genename引物類型1)Primertype1)引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)α-Amy1AFACCCAGGAGTACCATGCATCTTCRGTTCGTTCTCTAGTTGCGCGACα-Amy2AFGGCAACCCATGCATCTTCTACGRGAGTTCTAGTACGACGTGCTGCα-Amy3AFAATCTGGCTGTGAGGAGGTGACRCAGCAAACCCAAAGTAGGCTCGTα-Amy3BFACAACCATGACACTGGCTCCACRGTGTGGGACCTCATGGGACGTA?AAα-Amy3CFACACAGAACTCATGGCCGTTCCRGTGTGGGACCTCATGGGACGTA?AAα-Amy3DFATAGCGGGCTCAAGCCCTA?AACTGRCGAGTTTGGTCAAAGATGTGCCGTα-Amy3EFAGCTTCGATCGATGTACGCTTCGRGCCTTACATGGGACAATTAG?GACGSuSy-1FCATCTCAGGCTGAGACTCTGARCAAATTCAATCGACCTTACTTSuSy-2FTCGGAGTTCAACCACAGGTTCCRGTTTCGCACACGAACTGTGGTA

1)F: 正向引物 Forward primer; R: 反向引物 Reverse primer.

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL 2007和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 貯藏物質(zhì)消耗量和利用率的動(dòng)態(tài)變化

種子萌發(fā)過程中Sh2甜玉米自交系BF109和Q267單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量和利用率的動(dòng)態(tài)變化見表2。由表2可以看出：隨著種子萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，自交系BF109和Q267的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量均逐漸升高，而單粒種子貯藏物質(zhì)利用率則呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，且2個(gè)自交系的單粒種子貯藏物質(zhì)利用率最高值出現(xiàn)的時(shí)間不同，分別為種子萌發(fā)6和8 d。

由表2還可見：與自交系BF109相比，自交系Q267的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量較低，但單粒種子貯藏物質(zhì)利用率卻較高。種子萌發(fā)2、4、8和10 d，2個(gè)自交系間的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量均存在顯著差異(P<0.05)；種子萌發(fā)4、8和10 d，2個(gè)自交系的單粒種子貯藏物質(zhì)利用率也存在顯著差異。種子萌發(fā)10 d時(shí)，自交系BF109和Q267的單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量分別較各自種子萌發(fā)2 d時(shí)增加了9.70和6.74 mg，說明在種子萌發(fā)過程中Sh2甜玉米不同自交系因種子萌發(fā)而消耗的貯藏物質(zhì)總量明顯不同。

2.2 總淀粉酶和蔗糖合成酶活性的動(dòng)態(tài)變化

種子萌發(fā)過程中Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子中總淀粉酶和蔗糖合成酶活性的變化見表3。由表3可見：種子萌發(fā)2～10 d，自交系BF109和Q267種子中的總淀粉酶和蔗糖合成酶活性總體呈先升高后降低的趨勢(shì)。在自交系BF109和Q267種子中，總淀粉酶酶活性分別在種子萌發(fā)6和8 d時(shí)達(dá)到最高值，分別為6.68和7.63 U·g-1；蔗糖合成酶酶活性則分別在種子萌發(fā)4和8 d時(shí)達(dá)到最高值，分別為1.59和1.50 U·g-1。

萌發(fā)時(shí)間/dGerminationtime單粒種子貯藏物質(zhì)消耗量/mgConsumptionofstoragesubstancesinsingleseedBF109Q267單粒種子貯藏物質(zhì)利用率UtilizationrateofstoragesubstancesinsingleseedBF109Q26721．58±0．04a1．37±0．02b# # 42．18±0．07a1．77±0．12b0．34±0．01b0．38±0．02a63．09±0．65a3．11±0．17a0．50±0．02a0．53±0．04a85．87±0．14a4．89±0．49b0．47±0．02b0．56±0．03a1011．28±0．37a8．11±0．41b0．44±0．05b0．53±0．03a

1)#: 數(shù)值接近0 The values are close to 0. 同行中不同的小寫字母表示2個(gè)自交系間同一指標(biāo)差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same row indicate the significant difference in the same index between two inbred lines (P<0.05)．

萌發(fā)時(shí)間/dGerminationtime總淀粉酶活性/U·g-1ActivityoftotalamylaseBF109Q267蔗糖合成酶活性/U·g-1ActivityofsucrosesynthaseBF109Q26721．88±0．17b4．11±0．95a1．35±0．05a1．42±0．06a44．09±0．37b5．83±0．09a1．59±0．03a1．40±0．03b66．68±0．09a7．19±0．37a1．48±0．01a1．40±0．13a85．84±0．21b7．63±0．04a1．37±0．11a1．50±0．06a105．86±0．56b6．70±0．11a1．34±0．05b1．47±0．07a

1)同行中不同的小寫字母表示2個(gè)自交系間同一指標(biāo)差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same row indicate the significant difference in the same index between two inbred lines (P<0.05)．

由表3還可見：在種子萌發(fā)過程中，自交系Q267種子中的總淀粉酶活性均高于BF109，種子萌發(fā)2、8和10 d時(shí)前者的蔗糖合成酶活性也高于后者。其中，種子萌發(fā)2、4、8和10 d時(shí)Q267種子中的總淀粉酶活性顯著高于BF109(P<0.05)；Q267種子中的蔗糖合成酶活性在種子萌發(fā)4 d時(shí)顯著低于BF109，而在種子萌發(fā)10 d時(shí)則顯著高于BF109，即在種子萌發(fā)后期，Sh2甜玉米自交系Q267種子的總淀粉酶和蔗糖合成酶活性總體上高于自交系BF109。

2.3α-淀粉酶和蔗糖合成酶相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)種子萌發(fā)過程中Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子中9個(gè)α-淀粉酶和蔗糖合成酶相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

由表4可以看出：Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶相關(guān)基因(包括α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3D和α-Amy3E基因)和蔗糖合成酶相關(guān)基因(包括SuSy-2和SuSy-3基因)的相對(duì)表達(dá)量變化差異較大。其中，α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3D和SuSy-2基因的相對(duì)表達(dá)量在種子萌發(fā)2～10 d時(shí)相對(duì)較高，而α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3E和SuSy-3基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H在種子萌動(dòng)期(萌發(fā)2 d)較高，說明α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3D和SuSy-2基因可能是影響Sh2甜玉米種子萌發(fā)的關(guān)鍵水解酶基因。

由表4還可見：種子萌發(fā)2 d時(shí)Sh2甜玉米自交系BF109和Q267的α-淀粉酶基因和蔗糖合成酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量間均存在顯著差異(P<0.05)?？傮w上看，種子萌發(fā)期間自交系BF109種子中9個(gè)α-淀粉酶和蔗糖合成酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量低于自交系Q267。

萌發(fā)時(shí)間/dGerminationtimeα-Amy1A相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy1ABF109Q267α-Amy2A相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy2ABF109Q267α-Amy3A相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy3ABF109Q26720．20±0．01b1．00±0．10a7．66±0．35a1．00±0．10b0．62±0．02b1．00±0．02a413．00±0．47a1．02±0．10b0．39±0．05b0．83±0．13a# 0．07±0．0060．06±0．00b106．32±6．34a0．09±0．01b4．31±0．16a- - 81．20±0．10b3．27±0．11a0．99±0．01a1．05±0．07a- - 100．10±0．00b3．80±0．35a6．98±0．55a2．91±0．18b- -

萌發(fā)時(shí)間/dGerminationtimeα-Amy3B相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy3BBF109Q267α-Amy3C相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy3CBF109Q267α-Amy3D相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy3DBF109Q26720．39±0．01b1．00±0．10a0．40±0．01b1．00±0．03a0．17±0．01b1．00±0．03a4# 0．05±0．000．03±0．00a0．05±0．00a0．73±0．03b1．02±0．00a6# # # 0．23±0．010．04±0．00b18．36±0．77a8# # # 0．01±0．000．11±0．00b0．33±0．02a10### 0．01±0．000．03±0．00b0．08±0．01a

萌發(fā)時(shí)間/dGerminationtimeα-Amy3E相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressionofα-Amy3EBF109Q267SuSy-2相對(duì)表達(dá)量RelativeexpressionofSuSy-2BF109Q267SuSy-3相對(duì)表達(dá)量RelativeexpressionofSuSy-3BF109Q26720．44±0．03b1．00±0．01a0．54±0．01b1．00±0．03a0．02±0．00b1．00±0．01a40．01±0．00b0．05±0．00a0．68±0．02b1．08±0．00a- - 6# 0．31±0．010．07±0．00b3．30±0．14a- - 8- - 0．52±0．10a0．02±0．00b- - 10--# 0．01±0．00- -

1)#: 數(shù)值接近0 The values are close to 0; -: 未測(cè)出 Undetected. 同行中不同的小寫字母表示2個(gè)自交系間同一基因的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same row indicate the significant difference in relative expression of the same gene between two inbred lines(P<0.05)．

3 討 論

種子萌發(fā)主要是指胚乳中的貯藏物質(zhì)在酶的作用下水解并形成新組織或新器官[15]。Cheng等[16]發(fā)現(xiàn)，水稻種子萌發(fā)4 d時(shí)其胚乳中的貯藏物質(zhì)進(jìn)入快速分解階段；而在本研究中，Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子胚乳中的貯藏物質(zhì)在種子萌發(fā)6 d時(shí)進(jìn)入快速分解階段。種子萌發(fā)過程中(萌發(fā)2～10 d)，Sh2甜玉米自交系BF109和Q267的種子貯藏物質(zhì)消耗量和利用率存在較大差異，其中BF109的種子貯藏物質(zhì)消耗量基本上高于Q267，而其貯藏物質(zhì)利用率卻低于Q267，并且在種子萌發(fā)4、8和10 d時(shí)2個(gè)自交系的種子貯藏物質(zhì)消耗量和利用率均存在顯著差異(P<0.05)。表明在種子萌發(fā)過程中，物質(zhì)消耗量高的種子，其種子貯藏物質(zhì)利用率不一定高，即種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)消耗量與利用率間不相關(guān)。

植物種子中的淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶，其中，α-淀粉酶主要影響種子萌發(fā)后期幼苗生長(zhǎng)的速率[2,7,17-19]，而β-淀粉酶則主要在種子萌發(fā)早期通過降解淀粉促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明：Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子中的總淀粉酶活性存在一定差異，分別在種子萌發(fā)的2～6 和2～8 d持續(xù)升高，其中BF109種子中的總淀粉酶活性在種子萌發(fā)6 d時(shí)達(dá)到最高(6.68 U·g-1)，而Q267種子中的總淀粉酶活性則在種子萌發(fā)8 d時(shí)達(dá)到最高(7.63 U·g-1)，這可能與種子萌發(fā)前期β-淀粉酶的不斷釋放及α-淀粉酶的大量合成有關(guān)。

植物種子中的α-淀粉酶合成主要受GA和ABA的調(diào)控[12,19-20]，并且種子中的α-淀粉酶相關(guān)基因(包括α-Amy1A、α-Amy3B、α-Amy3D和α-Amy3E基因)在不同組織中具有表達(dá)特異性[6,13]。Sh2甜玉米自交系BF109和Q267種子中的7個(gè)α-淀粉酶相關(guān)基因 (包括α-Amy1A、α-Amy2A、α-Amy3A、α-Amy3B、α-Amy3C、α-Amy3D和α-Amy3E基因)主要在種子萌發(fā)前期表達(dá)，這一表達(dá)特性有利于種子在萌發(fā)前期盡快合成α-淀粉酶以便將胚乳中的淀粉水解為小分子的碳水化合物，為幼苗生長(zhǎng)提供充足的能量。相比較而言，在種子萌發(fā)過程中，自交系Q267種子中的α-淀粉酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量大多顯著高于自交系BF109，致使Q267種子中的總淀粉酶活性較高，推測(cè)這可能與萌發(fā)后期自交系Q267種子中不需要為合成新的α-淀粉酶而消耗大量貯藏物質(zhì)有關(guān)。

蔗糖合成酶在作物生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要作用。相關(guān)研究結(jié)果顯示蔗糖合成酶能夠影響豆科(Fabaceae)植物根瘤的固氮代謝及其韌皮部的運(yùn)輸能力[8,21]；另外，蔗糖合成酶還是受多基因編碼調(diào)控的酶類[14]。本研究中，種子萌發(fā)期間2個(gè)Sh2甜玉米自交系種子的蔗糖合成酶活性存在明顯差異，在種子萌發(fā)過程中SuSy-2基因的相對(duì)表達(dá)量一直高于SuSy-3基因，提示該基因可能在種子萌發(fā)過程中對(duì)貯藏物質(zhì)利用具有重要作用。自交系Q267種子中的SuSy-2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于自交系BF109，使Q267種子中的蔗糖合成酶活性相對(duì)較高，推測(cè)這可能與萌發(fā)后期Q267種子中不需要合成新的蔗糖合成酶而消耗大量貯藏物質(zhì)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

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Dynamic analyses on key hydrolytic enzyme activity and related gene expression of two inbred lines ofSh2 sweet corn during seed germination process

CHENG Xinxin①, NIU Yongsheng, LIU Zheng

(Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 18-24

In order to clarifying the effect of key hydrolytic enzymes on storage substance utilization in seed ofSh2 sweet corn (Zeamayssubsp.saccharataSturt.) during seed germination process, taking seeds of inbred line BF109 and Q267 ofSh2 sweet corn as materials, consumption and utilization rate of storage substances and activities of total amylase and sucrose synthase were detected when seed germinated for 2, 4, 6, 8 and 10 d, and expression characteristics of nine related genes were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR technology. The results show that consumption of storage substances in single seed of two inbred lines increases greatly when seed germinates for 6 d, meaning that storage substances in seed enter fast decomposition stage. With prolonging of germination time, consumption of storage substances in single seed of two inbred lines increases gradually, while utilization rate of storage substances appears the trend of firstly increasing and then decreasing. On the whole, consumption of storage substances in single seed of inbred line BF109 is significantly higher than that of inbred line Q267 (P<0.05), while its utilization rate of storage substances is significantly lower than that of the latter. With prolonging of germination time, activities of total amylase and sucrose synthase in seed of two inbred lines also generally appear the trend of firstly increasing and then decreasing, and activities of two enzymes in seed of inbred line BF109 are basically lower or significantly lower than those of inbred line Q267. Analysis result of real-time fluorescence quantitative PCR shows that during seed germination for 2-10 d, there is a great difference in relative expression of nine genes related toα-amylase and sucrose synthase in two inbred line seeds, but relative expressions of seven genes related toα-amylase includingα-Amy1A,α-Amy2A,α-Amy3A,α-Amy3B,α-Amy3C,α-Amy3Dandα-Amy3Eall are higher at the early germination stage, which is beneficial to synthetizeα-amylase and involve in starch hydrolysis. Relative expressions ofα-Amy1A,α-Amy2A,α-Amy3DandSuSy-2 genes all are higher during seed germination for 2-10 d, while those ofα-Amy3A,α-Amy3B,α-Amy3C,α-Amy3EandSuSy-3 genes are higher only when seed germinates for 2 d, meaning thatα-Amy1A,α-Amy2A,α-Amy3DandSuSy-2 genes are probably key hydrolytic enzyme genes ofSh2 sweet corn during seed germination process. Overall, relative expressions of related genes in seed of inbred line Q267 are significantly higher than those of inbred line BF109; it may be the main reason for causing higher activities of total amylase and sucrose synthase and higher utilization rate of storage substances in seed of inbred line Q267.

Sh2 sweet corn (Zeamayssubsp.saccharataSturt.); seed germination; utilization rate of storage substances; amylase; sucrose synthase； gene expression

2015-01-19

國家自然科學(xué)基金委員會(huì)生命科學(xué)部應(yīng)急管理項(xiàng)目(31440066)； 國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101598)； 安徽省教育廳自然科學(xué)資金項(xiàng)目(KJ2013B79)； 安徽科技學(xué)院省級(jí)科研平臺(tái)開放課題資助項(xiàng)目(ZRC2013392)

程昕昕(1978—)，女，山西浮山人，博士，副教授，主要從事甜玉米種子科學(xué)與技術(shù)方面的研究。

①通信作者 E-mail： chenxin0901@163.com

Q946-33； S513.032

A

1674-7895(2015)03-0018-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.03