楊 穎, 李火根

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037)

北美鵝掌楸NAC基因的克隆與表達(dá)分析

楊 穎, 李火根①

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037)

基于鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)北美鵝掌楸(L.tulipiferaLinn.)NAC(NAM、ATAF1/2及CUC2)家族基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。采用RACE技術(shù)從北美鵝掌楸葉片中克隆出16個(gè)LtNAC基因的開放閱讀框(ORF)，編號(hào)為L(zhǎng)tNAC01至LtNAC16。16個(gè)LtNAC基因的ORF長(zhǎng)度為561～1 830 bp，編碼187～610個(gè)氨基酸。根據(jù)理論等電點(diǎn)(pI),在LtNAC基因編碼的16個(gè)LtNAC蛋白中，9個(gè)為堿性蛋白質(zhì)，7個(gè)為酸性蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性(GRAVY),16個(gè)LtNAC蛋白中，13個(gè)為親水蛋白質(zhì)，3個(gè)為兩性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：16個(gè)LtNAC蛋白均以無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件，α螺旋、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明：北美鵝掌楸16個(gè)LtNAC基因可能并不參與細(xì)胞壁的生物合成，其中，LtNAC02、LtNAC03和LtNAC04基因可能參與北美鵝掌楸的脅迫響應(yīng)。LtNAC03、LtNAC07、LtNAC08、LtNAC09、LtNAC11、LtNAC12、LtNAC14、LtNAC15和LtNAC16 基因的相對(duì)表達(dá)量與北美鵝掌楸葉片衰老程度呈現(xiàn)相關(guān)性，推測(cè)該9個(gè)LtNAC基因可能參與調(diào)控葉片衰老。

北美鵝掌楸;LtNAC基因; 葉片衰老; qRT-PCR

植物NAC(NAM、ATAF1/2及CUC2)基因家族是植物特有的、最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族。該基因家族成員有一個(gè)共同的、保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即N端的NAC保守結(jié)構(gòu)域；相反，其C端(通常包含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)的長(zhǎng)度與序列組成高度變異。最早的研究發(fā)現(xiàn)NAC基因的功能與頂端分生組織(SAM)及子葉中的器官分離有關(guān)[1-2]。隨后的研究結(jié)果表明：NAC基因家族對(duì)于植物器官邊界的建成[3-5]、葉緣形態(tài)發(fā)育[3,6-8]、細(xì)胞次生壁合成[9-12]、葉片衰老[13-17]以及植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)[18-19]等多個(gè)生物學(xué)階段的基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。

葉片衰老是葉片發(fā)育的重要階段，其生物學(xué)意義是將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從正在衰老的器官中轉(zhuǎn)移到仍在生長(zhǎng)的組織中，最終轉(zhuǎn)移到發(fā)育中的種子中[20]。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，葉片延長(zhǎng)綠葉期意味著將會(huì)產(chǎn)生更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，然而，在種子成熟階段延遲衰老將導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降，這對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[21]。NAC基因家族是調(diào)控葉片衰老的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族。在大麥(HordeumvulgareLinn.)[21]、柳枝稷(PanicumvirgatumLinn.)[22]和擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[14]中均發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控葉片衰老的NAC基因，它們對(duì)植物葉片衰老起到正向或負(fù)向的調(diào)控作用。

目前，關(guān)于植物NAC基因?qū)α帜救~片衰老的調(diào)控機(jī)制的研究還未見(jiàn)報(bào)道。北美鵝掌楸(LiriodendrontulipiferaLinn.)是原產(chǎn)北美東部的落葉大喬木，屬于古老的被子植物，在植物進(jìn)化研究中占據(jù)舉足輕重的地位，因此，研究北美鵝掌楸NAC基因?qū)θ~片衰老的調(diào)控作用具有非常重要的意義。

本文以北美鵝掌楸為研究對(duì)象，通過(guò)挖掘北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組信息，采用RACE技術(shù)分離克隆NAC家族基因，同時(shí)，利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因定量表達(dá)分析，以初步分析LtNAC基因的功能，以期為鵝掌楸屬(LiriodendronLinn.)植物葉片衰老調(diào)控及候選基因篩選提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料均采自南京林業(yè)大學(xué)下蜀實(shí)習(xí)林場(chǎng)鵝掌楸種源試驗(yàn)林。于2014年5月采集成年北美鵝掌楸剛剛開始黃化的葉片(ES)作為基因克隆材料；為研究葉片不同衰老階段的基因表達(dá)，同年9月，采集成年北美鵝掌楸相同冠層、相同方位不同生長(zhǎng)階段的葉片，包括嫩葉(LY)、完全展開未衰老葉片(LEN)、衰老早期葉片(LE)以及衰老后期葉片(LL)4種類型的葉片，其中嫩葉為完全張開且中脈長(zhǎng)度5～6 cm的葉片；完全展開未衰老葉片為中脈長(zhǎng)度9～10 cm的綠色葉片；衰老早期葉片為葉表黃化面積小于25%且中脈長(zhǎng)度9～10 cm的葉片；衰老后期葉片為葉表黃化面積大于50%且中脈長(zhǎng)度9～10 cm的葉片。每種類型葉片各取3枚，液氮速凍后，帶回實(shí)驗(yàn)室并于-80 ℃保存。

1.2 基因克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 作者所在實(shí)驗(yàn)室前期已利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)鵝掌楸〔L.chinense(Hemsl.) Sarg.〕的花瓣和葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)拼接共獲得87 841 unigene，并進(jìn)行功能注釋[23]。從Pfam的注釋結(jié)果中搜索包含NAC結(jié)構(gòu)域的序列。Liang等[24]利用454測(cè)序平臺(tái)開發(fā)了北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ancangio.uga.edu/content/liriodendron-tulipifera)，其unigene的序列平均長(zhǎng)度為478 bp。為獲得北美鵝掌楸NAC家族基因信息，將已經(jīng)搜索到的鵝掌楸NAC結(jié)構(gòu)域序列與北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得目的基因片段序列信息，根據(jù)目的基因片段序列設(shè)計(jì)RACE引物。

1.2.2 RNA提取及克隆 采用RNA Prep Pure Tissue Kit試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕克隆全長(zhǎng)目的基因。5′RACE反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa 5′-Full RACE Kit with ATP試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕，3′RACE反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕。用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit〔賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司〕合成第1鏈cDNA并用于全長(zhǎng)開放閱讀框(ORF)的擴(kuò)增。具體操作步驟參照各試劑盒說(shuō)明書。

1.3LtNAC基因的生物信息學(xué)分析

采用ExPASy提供的在線工具Protparam(http:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)預(yù)測(cè)的北美鵝掌楸NAC基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用在線工具SOPMA對(duì)北美鵝掌楸NAC基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[25]，并預(yù)測(cè)其α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等在整體結(jié)構(gòu)中所占的比例。采用在線分析軟件TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。

從擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR，http:∥www.arabidopsis.org/)中下載擬南芥所有105個(gè)NAC家族成員(ANAC001至ANAC105)的蛋白質(zhì)序列。同時(shí)，從GenBank下載23個(gè)其他物種中已驗(yàn)證功能的NAC蛋白序列，包括水稻(OryzasativaLinn.)的OsNAP(NP_912423)、OsNAC4(BAA89798)、OsNAC5(BAA89799)、OsNAC6(BAA89800)和OsNAC9，大麥的NAM-B1(ACL31422.1)，BambusaemeiensisL. C. Chia et H. L. Fung的BeNAC1(ADP69102.1)，Ipomoeanil(Linn.) Roth的InNAP(BAO57486.1)，MedicagotruncatulaGaertn.的MtNAM(AFI56799.1)，Petunia×hybridaE. Vilm.的NAM(CAA63102)，SolanumlycopersicumLinn.的GOBLET(HM210879.1)以及PopulustrichocarpaTorr. et A.Gray ex Hook.的PtrWND1A(NAC068，XM_002317023)、PtrWND1B(NAC063， XM_002300464)、 PtrWND2A (NAC065， XM_002320861)、PtrWND2B(NAC061， XM_002302636)、PtrWND3A(NAC050，XM_002322362)、PtrWND3B(NAC037，XM_002318252)、PtrWND4A(NAC038， XM_002329829)、 PtrWND4B (NAC046， XM_002304392)、PtrWND5A(NAC025，XM_002310261)、PtrWND5B(NAC039，XM_002327730)、PtrWND6A(NAC055，XM_002327206)和PtrWND6B(NAC060，XM_002325955)12個(gè)NAC蛋白質(zhì)序列。將北美鵝掌楸LtNAC基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域序列和上述NAC蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域序列一起進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用Clustal X(version 1.83)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多序列比對(duì)。利用MEGA 6.0軟件、采用neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建無(wú)根的系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap test值設(shè)為1 000。

1.4LtNAC基因的qRT-PCR分析

采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR的LtNAC基因和內(nèi)參基因的引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 北美鵝掌楸LtNAC基因和內(nèi)參基因的引物序列

Table 1 Primer sequence ofLtNACgene and internal control gene fromLiriodendrontulipiferaLinn.

引物 Primer序列(5′→3′)Sequence(5′→3′) 引物 Primer序列(5′→3′)Sequence(5′→3′) LtNAC01FCGATCGCCGATGTTGATCT LtNAC09RCACCCCCTTGCAAGTCACAT LtNAC01RCGGTCCCGAAGACTGAAGAA LtNAC10FGATGAAGCAGGCGGTAGCA LtNAC02FATTCCATGTTTGTTGTTGACGAA LtNAC10RCGGTCTCTACCGGACCCATT LtNAC02RACCGCAGGCAGAACATTATCA LtNAC11FTTGCCTCCTGGGTTCAGATT LtNAC03FCCCATGTGAGTGGGCTGATT LtNAC11RGAATGATCAAAGCGGGCAAA LtNAC03RAGCACGTGTAAGTTCGAGTCCTT LtNAC12FATCCAAGCCTTGCCCTGTCT LtNAC04FCCCAAGGGTGAGAAAACGAA LtNAC12RCCACTCATTCTCTCCGAATTCC LtNAC04RCCCAATCGTCCAGCCTTAAG LtNAC13FGATTGGGATGATGATGTGG LtNAC05FGCCACCAGGGTTCAGGTTCTA LtNAC13RAATGAATCACAACCTATCCC LtNAC05RCACCAAGGTCCCATGAGAAAG LtNAC14FCTAAAGAATGTCTCATGACTAAAATGCA LtNAC06FAAGTTGACCCTATTACGCC LtNAC14RGCATACACGTAACATCCAAGTTGTC LtNAC06RTGATACTTGGGCGGAGC LtNAC15FAAGCTTTGTGGAGGCGAAATT LtNAC07FGCATCCGGCCTAGATAAGCA LtNAC15RCCCTTTGCCGGTAACCTTTT LtNAC07RTCCCCTTTGAAGGCTTTCCT LtNAC16FCTCAGAATGAATGGGTGA LtNAC08FGTGGGAGGCAAGGAATGGT LtNAC16RCCTCACAAGTCCTCGAAAG LtNAC08RTCGCCTTCCAGTACCCTGAT ActinFGATGGGCAGGTGATCACGAT LtNAC09FGGGCTGAGCAGGCACTTCT ActinRTCTCATGGATTCCAGCAGCTT

對(duì)于各RNA樣本，cDNA第1條鏈的合成采用第1鏈cDNA合成試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書。使用1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到20 μL產(chǎn)物cDNA，作為qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。qRT-PCR使用光學(xué)96孔平板在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)中進(jìn)行。采用單一PCR擴(kuò)增法：樣本和內(nèi)對(duì)照分別在獨(dú)立的反應(yīng)孔中進(jìn)行擴(kuò)增。使用actin作為內(nèi)對(duì)照，每個(gè)樣本和內(nèi)對(duì)照使用3個(gè)重復(fù)反應(yīng)孔進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。20.0 μL的反應(yīng)體系包括10.0 μL SYBRMIX、10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、0.8 μL第1鏈cDNA模板(40 ng)及8.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件如下：50 ℃， 2 min； 95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；60 ℃，60 s；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)熔解曲線鑒定產(chǎn)物的特異性。采用2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1LtNAC基因的克隆與序列分析

利用RACE技術(shù)從北美鵝掌楸葉片中共克隆出16個(gè)包含完整ORF的NAC基因，分別命名為L(zhǎng)tNAC01至LtNAC16，ORF長(zhǎng)度為561～1 830 bp，編碼187～610個(gè)氨基酸。

北美鵝掌楸LtNAC家族基因編碼的16個(gè)LtNAC蛋白的理化性質(zhì)見(jiàn)表2。由表2可以看出：其中9個(gè)LtNAC蛋白的理論等電點(diǎn)(pI)大于7，屬于堿性蛋白質(zhì)；另外7個(gè)LtNAC蛋白的pI值小于7，屬于酸性蛋白質(zhì)。LtNAC16和LtNAC08蛋白的氨基酸數(shù)目較少，分別為187和190，二者的理論相對(duì)分子質(zhì)量也較小，分別為21 811.9和21 667.3。LtNAC02蛋白的氨基酸數(shù)目最多(610)，其理論相對(duì)分子質(zhì)量也最大，為68 011.5。

表2 北美鵝掌楸LtNAC家族基因編碼的LtNAC蛋白的理化性質(zhì)1)

Table 2 Physical-chemical property of LtNAC protein encoded byLtNACfamily gene fromLiriodendrontulipiferaLinn.1)

蛋白質(zhì)ProteinNMWpIIGRAVYLtNAC0131335191．88．8355．46-0．688LtNAC0261068011．54．6967．77-0．527LtNAC0358164433．74．7768．98-0．471LtNAC0430034450．08．3959．53-0．764LtNAC0528932813．16．4067．13-0．595LtNAC0642848434．05．3461．94-0．881LtNAC0725628928．69．4160．86-0．676LtNAC0819021667．35．2171．84-0．489LtNAC0944249769．56．2157．58-0．925LtNAC1035740342．26．8170．50-0．677LtNAC1124427741．39．5557．54-0．789LtNAC1227531528．47．6658．15-0．776LtNAC1326229934．88．0158．62-0．653LtNAC1446952566．47．7270．30-0．466LtNAC1526429743．97．6966．78-0．530LtNAC1618721811．99．3457．63-0．896

1)N: 氨基酸數(shù)目 Number of amino acids; MW: 理論相對(duì)分子質(zhì)量 Theoretical relative molecular weight; pI: 理論等電點(diǎn) Theoretical isoelectric point; I: 脂肪族氨基酸指數(shù) Aliphatic amino acid index; GRAVY: 蛋白質(zhì)疏水性 Grand average of hydropathicity.

蛋白質(zhì)疏水性(GRAVY)的分析結(jié)果顯示：16個(gè)LtNAC蛋白的GRAVY值均為負(fù)值，其中13個(gè)LtNAC蛋白的GRAVY值小于-0.5，為親水蛋白質(zhì)；只有LtNAC03、LtNAC08和LtNAC14蛋白的GRAVY值大于-0.5，分別為-0.471、-0.489和-0.466，為兩性蛋白質(zhì)。

2.2LtNAC基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA程序?qū)?6個(gè)北美鵝掌楸LtNAC家族基因編碼的LtNAC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出：16個(gè)LtNAC蛋白均以無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件，其中LtNAC03蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最少，僅39.59%；LtNAC04蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，達(dá)到61.00%；α螺旋、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)LtNAC蛋白中。

蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)研究結(jié)果顯示：16個(gè)LtNAC蛋白中，LtNAC02和LtNAC03蛋白包含跨膜基序(TM，transmembrane motif)，且TM都存在于C端。

表3 北美鵝掌楸LtNAC家族基因編碼的LtNAC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 3 Predicting result of secondary structure of LtNAC protein encoded byLtNACfamily gene fromLiriodendrontulipiferaLinn.

蛋白質(zhì)Protein不同構(gòu)成元件所占比例/%Percentageofdifferentcomponentsα螺旋αhelix延伸鏈Extendedstrandβ轉(zhuǎn)角βturn無(wú)規(guī)則卷曲RandomcoilLtNAC0114．0622．688．6354．63LtNAC0221．8020．829．6747．70LtNAC0331．5018．2410．6739．59LtNAC0416．0017．675．3361．00LtNAC0518．3427．348．3046．02LtNAC0624．5318．698．6448．13LtNAC0720．7023．0510．1646．09LtNAC0818．4218．959．4753．16LtNAC0923．9818．108．1449．77LtNAC1021．8519．616．4452．10LtNAC1115．1624．596．9753．28LtNAC1217．8222．186．5553．45LtNAC1318．3919．547．6654．41LtNAC1422．1623．2411．3543．24LtNAC1514．3922．357．5855．68LtNAC1616．6729．5711．8341．94

2.3LtNAC基因編碼的蛋白質(zhì)的聚類分析

對(duì)北美鵝掌楸16個(gè)LtNAC基因編碼的LtNAC蛋白與擬南芥及23個(gè)其他物種中功能已知的NAC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用保守的N端的NAC保守結(jié)構(gòu)域?qū)AC蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出：144個(gè)NAC蛋白被劃分為NAC-Ⅰ、NAC-Ⅱ、NAC-Ⅲ、NAC-Ⅳ、NAC-Ⅴ、NAC-Ⅵ、NAC-Ⅶ和NAC-Ⅷ 8類，8類中分別包含0、2、0、1、5、4、0和4個(gè)LtNAC蛋白。其中，NAC-Ⅶ類被認(rèn)為與細(xì)胞壁生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，而北美鵝掌楸16個(gè)LtNAC基因編碼的LtNAC蛋白均未出現(xiàn)在NAC-Ⅶ類中，說(shuō)明北美鵝掌楸LtNAC基因可能未參與細(xì)胞壁的生物合成。

2.4LtNAC基因在葉片不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)分析

北美鵝掌楸16個(gè)LtNAC基因在葉片不同生長(zhǎng)階段的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2。由圖2可以看出：北美鵝掌楸LtNAC03、LtNAC07、LtNAC08、LtNAC09、LtNAC11、LtNAC12、LtNAC15和LtNAC16 基因在嫩葉、完全展開未衰老葉片、衰老早期葉片和衰老后期葉片中的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)，推測(cè)這些基因可能正向調(diào)控植物葉片的衰老。而LtNAC14基因在完全展開未衰老葉片、衰老早期葉片和衰老后期葉片中的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，推測(cè)該基因可能是葉片衰老的負(fù)向調(diào)控因子。

圖中涉及16個(gè)北美鵝掌楸NAC蛋白(LtNAC01至LtNAC16)、105個(gè)擬南芥NAC蛋白(ANAC001至ANAC105)和23個(gè)其他物種已知的NAC蛋白，其中，16個(gè)LtNAC蛋白用“●”標(biāo)出 Proteins in this figure include 16 NAC proteins fromL.tulipifera(from LtNAC01 to LtNAC16), 105 NAC proteins fromA.thaliana(from ANAC001 to ANAC105) and 23 known NAC proteins from other plants, in which, 16 LtNAC proteins are marked with “●”.

圖1 北美鵝掌楸LtNAC蛋白與擬南芥NAC蛋白及23個(gè)其他物種已知NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig. 1 Phylogenetic analysis on LtNAC protein fromLiriodendrontulipiferaLinn.， NAC protein from

Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh. and 23 known NAC proteins from other plants

RE: 相對(duì)表達(dá)量Relative expression. LY: 嫩葉Young leaf; LEN: 完全展開未衰老葉片F(xiàn)ully expanded and non-senescent leaf; LE: 衰老早期葉片Leaf at the early stage of senescence; LL: 衰老后期葉片Leaf at the late stage of senescence.

1：LtNAC01基因LtNAC01 gene; 2:LtNAC02基因LtNAC02 gene; 3:LtNAC03基因LtNAC03 gene; 4:LtNAC04基因LtNAC04 gene; 5:LtNAC05基因LtNAC05 gene; 6:LtNAC06基因LtNAC06 gene; 7:LtNAC07基因LtNAC07 gene; 8:LtNAC08基因LtNAC08 gene; 9:LtNAC09基因LtNAC09 gene; 10:LtNAC10基因LtNAC10 gene; 11:LtNAC11基因LtNAC11 gene; 12:LtNAC12基因LtNAC12 gene; 13:LtNAC13基因LtNAC13 gene; 14:LtNAC14基因LtNAC14 gene; 15:LtNAC15基因LtNAC15 gene; 16:LtNAC16基因LtNAC16 gene.

圖2 北美鵝掌楸16個(gè)LtNAC基因在葉片不同生長(zhǎng)階段的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 2 Relative expression of sixteenLtNACgenes at different growth stages of leaf ofLiriodendrontulipiferaLinn.

3 討 論

對(duì)北美鵝掌楸NAC預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化特征的分析結(jié)果顯示：16個(gè)LtNAC蛋白的GRAVY值均為負(fù)值，其中81.25%LtNAC蛋白的GRAVY值小于-0.5，與王洋等[26]對(duì)大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕的研究結(jié)果一致，152條大豆NAC蛋白的GRAVY平均值均為負(fù)值，且大多數(shù)小于-0.5。北美鵝掌楸全基因組范圍內(nèi)NAC家族理化性質(zhì)是否也具有相同特征尚待進(jìn)一步研究。

Ooka等[27]將擬南芥以及水稻全部NAC蛋白分為2個(gè)大類，分別包含14和4個(gè)亞類。Shen等[28]將11種植物的1 232個(gè)NAC蛋白分成8類。本研究中144個(gè)NAC蛋白序列共聚成8類，目前在不同植物NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化研究中，NAC蛋白被聚成不同數(shù)目的類別，它們均受到所分析的蛋白數(shù)目、采用的算法和軟件以及選用的是保守結(jié)構(gòu)域還是全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)等因素的影響。本研究采用的是使用較普遍的NAC保守結(jié)構(gòu)域及NJ法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示具有相同功能的基因編碼的蛋白趨向于劃分在同一類中。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，脅迫應(yīng)答NAC基因(SNAC)，包括水稻OsNAC4、OsNAC5、OsNAC6和OsNAC9(SNAC1)以及擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072 基因編碼的蛋白被歸到NAC-Ⅴ類中。Ricachenevsky等[29]認(rèn)為該類基因參與脅迫應(yīng)答的功能在不同物種中可能是保守的。在本研究中，LtNAC04基因與SNAC基因編碼的蛋白聚為一類，因而，從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上預(yù)測(cè)，LtNAC04 基因有可能與脅迫應(yīng)答有關(guān)。LtNAC蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)研究表明：LtNAC02和LtNAC03蛋白包含TM螺旋。植物NAC家族一些成員C端含有1個(gè)至多個(gè)α螺旋的跨膜基序，這些C端含有跨膜基序的NAC基因被稱為NTL(NTM1-like)。全基因組研究結(jié)果表明：擬南芥中有至少13個(gè)NTL(NTLs)、水稻中有5個(gè)NTL(OsNTLs)、馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)中有14個(gè)NTL[18]、大豆中有11個(gè)NTL[30]，這些NTL被發(fā)現(xiàn)參與植物的脅迫響應(yīng)[18]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，大多數(shù)擬南芥NTL聚集在NAC-Ⅵ類中；少數(shù)聚集在NAC-Ⅲ和NAC-Ⅳ類中；北美鵝掌楸LtNAC02和LtNAC03蛋白也聚集在NAC-Ⅵ類中，據(jù)此預(yù)測(cè)LtNAC02和LtNAC03 基因也可能參與北美鵝掌楸的脅迫響應(yīng)。

植物組織自然衰老過(guò)程的主要作用是在種子日漸飽滿的過(guò)程中完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。植物NAC基因?qū)θ~片衰老的調(diào)控作用包括正向調(diào)控作用和負(fù)向調(diào)控作用，正向調(diào)控基因如擬南芥的AtNAP[14]、ATAF1[31]、ORE1和ORS1(ORE1SISTER1)[32]，小麥(TriticumaestivumLinn.)的NAM-B1[17]，水稻的OsNAC5[33]及Bambusaemeiensis‘Viridiflavus’ 的BeNAC1[15]等；負(fù)向調(diào)控基因如JUB1[34]和VNI2[35]。本研究中北美鵝掌楸LtNAC03、LtNAC07、LtNAC08、LtNAC09、LtNAC11、LtNAC12、LtNAC15和LtNAC16 基因的相對(duì)表達(dá)量與葉片衰老程度呈正相關(guān)，為葉片衰老的正向調(diào)控候選因子；LtNAC14 基因的相對(duì)表達(dá)量與葉片衰老程度呈負(fù)相關(guān)，為葉片衰老的負(fù)向調(diào)控候選因子。在擬南芥的109個(gè)NAC基因家族成員中，其中約20%的基因在衰老葉片中表達(dá)[13]。在本研究中，北美鵝掌楸的16個(gè)LtNAC基因中有9個(gè)基因被認(rèn)為是與葉片衰老有關(guān)的候選基因，所占比例遠(yuǎn)高于擬南芥。這是由于本實(shí)驗(yàn)克隆獲得的北美鵝掌楸LtNAC基因均基于鵝掌楸葉片和花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，而在這2個(gè)組織中不表達(dá)的LtNAC基因無(wú)法克隆獲得，因此推測(cè)實(shí)際上與葉片衰老相關(guān)的LtNAC基因所占比例應(yīng)低于50%。

已有的研究結(jié)果顯示：不同植物的NAC基因可能作用于不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，處于同一信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的NAC基因也可能處于上、下游的不同位置，這些都可能是由于聚類上的分化導(dǎo)致的。如，在擬南芥Ethylene-insensitive2(EIN2)介導(dǎo)的葉片衰老代謝途徑中，信號(hào)傳遞分子EIN3直接結(jié)合ORE1和AtNAP的啟動(dòng)子并激活表達(dá)，且ORE1和AtNAP作用于2條不同但交叉的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[36]。Garapati等[31]認(rèn)為，ATAF1 基因是ABA和H2O2介導(dǎo)的衰老代謝途徑的上游調(diào)控因子，通過(guò)激活衰老調(diào)控NAC轉(zhuǎn)錄因子ORE1和抑制葉綠素維持關(guān)鍵因子GLK1 的表達(dá)使葉片向衰老轉(zhuǎn)變。Hollmann等[20]認(rèn)為，在冬季大麥葉片中HvNAC026是衰老相關(guān)的N元素再利用代謝途徑的重要調(diào)控基因，然而，同樣是衰老相關(guān)的基因，HvNAC001、HvNAC005和HvNAC013則可能并不參與N元素的回收再利用。北美鵝掌楸9個(gè)與葉片衰老相關(guān)的LtNAC基因被聚為多個(gè)類別。在9個(gè)LtNAC基因中，LtNAC12基因與許多已知的葉片衰老調(diào)控基因(如AtNAP、InNAP、BeNAC1、OsNAP及NAM-B1)聚在一起，它們都是經(jīng)過(guò)功能驗(yàn)證并在植物葉片衰老過(guò)程中起重要調(diào)控作用的基因。所以，LtNAC12 基因也可能在北美鵝掌楸葉片衰老的過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

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Cloning ofNACgene fromLiriodendrontulipiferaand its expression analysis

YANG Ying, LI Huogen①

(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 1-9

Based on the transcriptome data ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.， structure and function ofNAC(NAM,ATAF1/2 andCUC2) family genes fromL.tulipiferaLinn. were researched. Open reading frame (ORF) of 16LtNACgenes was cloned from leaf ofL.tulipiferaby RACE technology with Nos. fromLtNAC01 toLtNAC16. Length of ORF of 16LtNACgenes is 561-1 830 bp, and 187-610 amino acids are encoded. According to theoretical isoelectric point (pI), there are 9 basic proteins and 7 acidic proteins in 16 LtNAC proteins encoded byLtNACgenes. According to grand average of hydropathicity (GRAVY), there are 13 hydrophilic proteins and 3 hydrophonic proteins in 16 LtNAC proteins. The predicting result of secondary structure of LtNAC protein shows that random coil is main component in all of 16 LtNAC proteins, andαhelix, extended strand andβturn distribute widely in the whole protein. The result of phylogenetic analysis shows that 16LtNACgenes ofL.tulipiferamay not participate in cell wall biosynthesis, in which,LtNAC02，LtNAC03 andLtNAC04 genes may participate in stress response ofL.tulipifera. Relative expression ofLtNAC03,LtNAC07,LtNAC08,LtNAC09,LtNAC11,LtNAC12,LtNAC14,LtNAC15 andLtNAC16 genes is related to leaf senescence progression ofL.tulipifera, and it is predicted that the nineLtNACgenes may participate in regulating leaf senescence progression.

LiriodendrontulipiferaLinn.;LtNACgene; leaf senescence; qRT-PCR

2015-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31470660； 31170621)； 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

楊 穎(1988—)，女，江蘇南京人，博士研究生，主要從事森林遺傳學(xué)等方面的研究。

①通信作者 E-mail： hgli@njfu.edu.cn

Q943.2; S792.21

A

1674-7895(2015)03-0001-09

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.01