楊永峰, 孫啟祥

(1. 國家林業(yè)局調查規(guī)劃設計院, 北京 100714; 2. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所, 北京 100091)

烏桕葉片中抑螺提取物的主要化學成分分析

楊永峰1, 孫啟祥2

(1. 國家林業(yè)局調查規(guī)劃設計院, 北京 100714; 2. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所, 北京 100091)

烏桕; 釘螺; 抑螺成分; GC-MS

血吸蟲病是嚴重危害人類生命健康的寄生蟲病，中國是血吸蟲病流行最嚴重的國家之一[1-2],雖然近期得到了有效控制，但局部地區(qū)并不樂觀[3]。主要原因之一是無法有效控制血吸蟲病中間宿主釘螺的傳播。濕熱適宜地區(qū)釘螺生命力異?；钴S，很難徹底清除，致使部分區(qū)域血吸蟲病依然蔓延，因此，抑制釘螺即可有效控制血吸蟲病[4]。生物法是費效比最低、對環(huán)境污染最小的抑螺方法[5]。

烏桕〔Sapiumsebiferum(Linn.) Roxb.〕是重要的經(jīng)濟植物之一，在濕熱地區(qū)栽培甚廣[6]，也是一種很好的抑螺植物[4]。以烏桕林為主形成的微環(huán)境及產(chǎn)生的化感物質能顯著降低灘地釘螺密度與陽性感染螺密度[7]；烏桕葉片石油醚提取物具有很強的抑螺效果[8]。在前期工作的基礎上，作者結合抑螺實驗采用柱分離技術和GC-MS法，分離和鑒定抑螺提取物的主要成分，以期為血吸蟲病的防治提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

烏桕新鮮葉片于2013年5月采自湖北省林業(yè)科學研究院九峰林業(yè)基地。葉片用蒸餾水洗凈后，在60 ℃烘箱里烘干，粉碎后過30目篩，密封、備用。釘螺采自湖北省荊州市沙市區(qū)，在去氯水中飼養(yǎng)2 d(25 ℃)；挑選個體一致、活力較強的成螺進行實驗[7-8]。

正己烷、三氯甲烷和二氯甲烷均為分析純，重蒸后使用；甲醇為色譜純。薄層層析硅膠板GF254購自安徽良臣硅源材料有限公司；柱層析硅膠(0.075～0.150 mm，購自青島海洋化工廠。

1.2 方法

1.2.1 柱分離實驗

1.2.1.1 抑螺活性成分的粗分離 采用濕法將弗羅里硅土裝到填充柱中，用500 mL正己烷沖洗填充柱；裝入葉片粉末100 g并依次用正己烷、正己烷-二氯甲烷混合溶液(體積比1∶1)、二氯甲烷、甲醇洗脫，每種洗脫液1 L，以1 min 10滴左右的速度洗脫，收集洗脫液。以三氯甲烷-甲醇-蒸餾水混合溶液(體積比12∶7∶1)作為展開劑，用薄層硅膠板鑒別各洗脫液，經(jīng)熒光照射檢驗后合并洗脫成分相同的洗脫液，減壓濃縮、真空干燥。參照文獻[8]的方法進行抑螺實驗，確定抑螺效果顯著的提取物。

1.2.1.2 抑螺活性成分的細分離 采用濕法將200～300目硅膠裝入細分離層析柱中，先用300 mL甲醇沖洗凈化柱材料，再裝入抑螺效果顯著的提取物2 g，使用甲醇進行洗脫，并蒸餾水混合溶液(體積比12∶7∶1)作為展開劑，用薄層硅膠板鑒別各洗脫液，經(jīng)熒光照射檢驗后合并洗脫成分相同的洗脫液，減壓濃縮至干。參照文獻[8]的方法進行抑螺實驗，確定抑螺活性最強的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組提取物。每組分別取約2 mg提取物，溶解于1 mL正己烷中，用無水硫酸鈉脫水12 h以上，然后吸取2 μL進行GC-MS分析。

1.2.2 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀及條件 采用QP2010型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(日本島津公司)進行檢測。檢測條件為：DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；不分流進樣，進樣口溫度250 ℃。毛細管柱程序升溫條件為：初始溫度50 ℃，保 持2 min； 以1 ℃·min-1速率升溫至60 ℃， 保 持2 min； 以 3 ℃·min-1速率升溫至150 ℃，保持2 min；最后以10 ℃·min-1速率升溫至230 ℃，保持6 min。載氣為氦氣，恒壓模式分離。離子源溫度200 ℃；EI離子源，電離電壓70 eV；質量掃描范圍40～600 amu；傳輸線溫度250 ℃。

采用NIST 107及Wiley 6.0質譜圖庫，根據(jù)相似度初步確定各成分[9-10]。

2 結果和分析

烏桕葉片中抑螺提取物(Ⅰ～Ⅳ組)的抑螺活性成分的總離子流色譜圖見圖1。

由圖1-A可見，Ⅰ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有7個較大的色譜峰，初步確定化合物1為3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol(3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇)，相似度91%；化合物2為6-chloro-N-ethyl-1，3，5-triazine-2，4-diamine(6-氯-N-乙基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)，相似度85%；化合物3為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度91%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇,相似度93%；化合物5為hexadecanoic acid(棕櫚酸)，相似度96%；化合物6為9，12，15-octadecatrienoic acid-2，3-dihydroxypropyl ester(9，12，15-三烯-十八酸-2，3-二丙二醇酯)，相似度86%；化合物7為octadecanoic acid(十八酸)，相似度87%。

由于化合物1、化合物3和化合物4的質譜圖極為相似，但保留時間不同，推測它們互為異構體，且3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇和棕櫚酸的峰面積較大，即二者相對含量較高，推測其是抑螺活性成分的幾率較高。

A. Ⅰ組抑螺提取物 Group Ⅰ of oncomelania-inhibited extract: 1,3,4: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 2: 6-chloro-N-ethyl-1，3，5-triazine-2，4-diamine; 5: hexadecanoic acid; 6: 9，12，15-octadecatrienoic acid-2，3-dihydroxypropyl ester; 7: octadecanoic acid. B. Ⅱ組抑螺提取物 Group Ⅱ of oncomelania-inhibited extract: 1: hexadecanoic acid methyl ester; 2: 9，12-octadecadienoic acid methyl ester; 3: 9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester; 4: octadecanoic acid methyl ester; 5: 1，2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl) ester. C. Ⅲ組抑螺提取物 Group Ⅲ of oncomelania-inhibited extract: 1: tetradecanoic acid; 2,4,5: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 3: 3，7，11-trimethyl-1-dodecanol; 6: 2，6，10-trimethyl-tetradecane; 7: hexadecanoic acid; 8: octadecanoic acid; 9: 1，2-benzenedicarboxylic acid bis(2-ethylhexyl) ester. D. Ⅳ組抑螺提取物 Group Ⅳ of oncomelania-inhibited extract: 1,2,3,4: 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 5: hexadecanoic acid; 6: 8，11，14-eicosatrienoic acid; 7: 9-octadecenoic acid; 8: 9-octadecenamide; 9: [(2-fluorophenyl)methyl]-1H-purin-6-amine.

圖1 烏桕葉片抑螺提取物(Ⅰ～Ⅳ組)的總離子流色譜圖

Fig. 1 Total ion chromatogram of oncomelania-inhibited extracts (groupⅠ-Ⅳ) from leaf ofSapiumsebiferum(Linn.) Roxb.

由圖1-B可見，Ⅱ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有5個較大的色譜峰，初步確定化合物1為hexadecanoic acid methyl ester(十六酸甲酯)，相似度97%；化合物2為9，12-octadecadienoic acid methyl ester(9，12-十八烯酸甲酯)，相似度97%；化合物3為9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester(9，12，15-十八烯酸甲酯)，相似度93%；化合物4為octadecanoic acid methyl ester(十八酸甲酯)，相似度97%；化合物5為1，2-benzenedicarboxylic acid bis (2-ethylhexyl) ester〔1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)〕，相似度97%。

由圖1-C可見，Ⅲ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有9個較大的色譜峰，初步確定化合物1為tetradecanoic acid(十四酸)，相似度95%；化合物2為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物3為3，7，11-trimethyl-1-dodecanol(3，7，11-三甲基-1-二十醇)，相似度86%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物5為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度95%；化合物6為2，6，10-trimethyl-tetradecane(2，6，10-三甲基-二十四烷)，相似度84%；化合物7為棕櫚酸，相似度93%；化合物8為octadecanoic acid(二十酸)，相似度94%；化合物9為1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)，相似度89%。

由圖1-D可見，Ⅳ組抑螺提取物的總離子流色譜圖有9個較大的色譜峰，初步確定化合物1為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物2為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物3為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度94%；化合物4為3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇，相似度93%；化合物5為棕櫚酸，相似度95%；化合物6為8，11，14-eicosatrienoic acid(8，11，14-烯-二十酸)，相似度89%；化合物7為9-octadecenoic acid(9-烯-十八酸)，相似度89%；化合物8為9-octadecenamide(9-烯-十八胺)，相似度98%；化合物9為[(2-fluorophenyl)methyl]-1H-purin-6-amine〔[(2-氟苯基)甲基]-1-H-吡啶-6-胺〕，相似度81%。

上述研究結果顯示：3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇、棕櫚酸、9，12，15-十八烯酸甲酯、1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)和8，11，14-烯-二十酸的相對峰面積較大。這些成分分別屬于烯醇、有機酸及酯類大分子化合物，沸點低于250 ℃、穩(wěn)定性好且較容易氣化，適合用氣相色譜測定。樣品中極性較大、沸點高、難以氣化的成分需進行HPLC-MS分析。

3 結 論

從烏桕葉片抑螺提取物中分離得到的3，7，11，15-四甲基-2-烯-1-十六醇、棕櫚酸、9，12，15-十八烯酸甲酯、1，2-苯二甲酸雙(2-乙基己酯)和8，11，14-烯-二十酸等成分的相對峰面積較大。由于棕櫚酸具有抑制胰島GLUT2、INS、PDX-1 mRNA表達[11]，導致肌細胞斷裂、凋亡[12]以及抗蟲[13]等的作用，因此，推測棕櫚酸是烏桕抑螺的活性物質之一。

相對于傳統(tǒng)的物理與化學藥物，植物抑螺具有經(jīng)濟高效、生態(tài)環(huán)保和效用持續(xù)等優(yōu)點，利用植物抑螺技術防治血吸蟲病有著極其廣闊的應用前景。研究烏桕葉片抑螺提取物的主要化學成分，不僅對興林抑螺和大力推廣生物措施防控血吸蟲病具有重要意義，還為利用烏桕防治血吸蟲病、定向選育高抑螺活性的烏桕品種及開展更有效的抑螺行動提供理論指導。本研究通過抑螺實驗結合GC-MS聯(lián)用分析獲得的研究結果，對烏桕葉片的抑螺研究具有重要的參考價值。但這些已鑒定的化合物抑螺效果如何，需要通過進一步的提純、合成以及單獨或聯(lián)合實驗加以驗證。

[1] 楊永峰, 彭鎮(zhèn)華, 孫啟祥, 等. 重大工程對血吸蟲病流行區(qū)擴散的潛在影響[J]. 長江流域資源與環(huán)境, 2009, 18(11): 1067-1073.

[2] 劉國華. 林業(yè)血防工程與血吸蟲病防治[J]. 濕地科學與管理, 2007, 3(2): 16-17.

[3] 楊二艷, 周立志, 方建民. 長江安慶段灘地鳥類群落多樣性及其季節(jié)動態(tài)[J]. 林業(yè)科學, 2014, 50(4): 77-83.

[4] 彭鎮(zhèn)華, 江澤慧. 中國新林種: 抑螺防病林研究[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1995: 3-9.

[5] LUO K S， HE Y C, XU L C, et al. Progress in researches on active constituents and molluscicidal activity ofSapiumsebiferum[J]. Chinese Journal of Schistosomiasis Control, 2013, 25: 538-540.

[6] 張克迪, 林一天. 中國烏桕[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1994: 8-20.

[7] 孫啟祥, 張建鋒, 周金星. 林業(yè)血防工程建設中的問題探討[J]. 濕地科學與管理, 2006, 2(4): 44-46.

[8] 楊永峰, 彭鎮(zhèn)華, 孫啟祥, 等. 烏桕抑螺效果的研究[J]. 濕地科學與管理, 2011, 7(2): 4-7.

[9] 譚和平, 譚福元, 鄒 燕, 等. 核磁共振技術在茶葉生化成分鑒定中的應用[J]. 中國測試, 2009, 35(6): 70-73.

[10] 鐘瑞敏, 曾慶孝, 張振明, 等. 氣質聯(lián)用結合保留指數(shù)對比在五種木蘭科芳香精油成分鑒定中的應用[J]. 分析測試學報, 2006, 25(5): 16-20.

[11] 張 麗, 高 聆, 梁 軍, 等. 棕櫚酸對胰島的脂毒性及非諾貝特的保護作用[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2005, 21(2): 155-158.

[12] 毛 軻. 棕櫚酸影響肌肉素基因的表達及其機制的初步研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院, 2014: 15-28.

[13] 戈 峰, 李鎮(zhèn)宇, 謝映平, 等. 我國主要松樹誘導抗蟲性的一些規(guī)律比較[J]. 北京林業(yè)大學學報, 2002, 24(3): 61-65.

(責任編輯: 張明霞)

Analysis on main chemical components in oncomelania-inhibited extracts from leaf ofSapiumsebiferum

YANG Yongfeng1, SUN Qixiang2

(1. Academy of Forestry Inventory and Planning, State Forestry Administration, Beijing 100714, China; 2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 115-117

Oncomelania-inhibited component in petroleum ether extracts from leaf ofSapiumsebiferum(Linn.) Roxb. was researched by column separation technology and GC-MS method, and compound separated from leaf was identified by NIST 107 and Wiley 6.0. The results show that relative peak areas of 3，7，11，15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol, hexadecanoic acid, 9，12，15-octadecadienoic acid methyl ester, 1，2-benzenedicarboxylic acid bis (2-ethylhexyl) ester and 8，11，14-eicosatrienoic acid are larger, and suggesting that they are the main oncomelania-inhibited compounds. In which, hexadecanoic acid may be one of active materials inhibiting oncomelania fromS.sebiferum. This result has an important value to extension of biological measure controlling schistosomiasis.

Sapiumsebiferum(Linn.) Roxb.; oncomelania; oncomelania-inhibited component; GC-MS

2015-03-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD38B07)

楊永峰(1983—)，男，安徽阜陽人，博士，主要從事濕地保護與管理和林業(yè)生態(tài)工程方面的研究。

Q946; Q949.99

A

1674-7895(2015)03-0115-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.17