文 先, 程 諾, 韓 婷, 陳貴林, 賈 敏,①, 秦路平,①

(1. 內(nèi)蒙古大學生命科學學院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021; 2. 第二軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室, 上海 200433)

產(chǎn)甘油三油酸酯的薏苡內(nèi)生真菌GibberellamoniliformisAH13發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

文 先1,2, 程 諾2, 韓 婷2, 陳貴林1,2, 賈 敏2,①, 秦路平2,①

(1. 內(nèi)蒙古大學生命科學學院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021; 2. 第二軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室, 上海 200433)

薏苡(Coixlacryma-jobiLinn.)為禾本科(Poaceae)薏苡屬(CoixLinn.)1年生草本植物，其干燥成熟種仁為薏苡仁，藥食兼用；薏苡仁中粗蛋白含量13%～14%，脂類含量2%～8%，且富含薏苡仁酯[1]。薏苡仁具有抗腫瘤[2-5]、提高機體免疫力[6]、降血糖[7-8]、抗炎鎮(zhèn)痛[9]、調(diào)節(jié)血脂代謝[10]和抑制骨質(zhì)疏松[11]等藥理作用。薏苡仁油中的主要抗腫瘤活性成分是甘油三酯類成分，該成分也是評價薏苡仁藥材質(zhì)量的指標成分[5]，以其為有效成分制成的注射用乳劑(即康萊特注射液)現(xiàn)已作為中國臨床普遍應(yīng)用的抗腫瘤藥[5]。

1993年，Stierle等首次分離獲得與宿主產(chǎn)生相同成分(即紫杉醇)的內(nèi)生真菌[12]，此后，國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性成分并不是個別現(xiàn)象，不僅先后從紅豆杉屬(TaxusLinn.)的其他植物中再次分離得到產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌[13]，還分別從喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)、長春花〔Catharanthusroseus(Linn.) G. Don〕、蛇足石杉〔Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev.〕、貫葉連翹(HypericumperforatumLinn.)、足葉草(PodophyllumpeltatumLinn.)、平貝母(FritillariaussuriensisMaxim.)、杜仲(EucommiaulmoidesOliver)、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)和甘肅棘豆(OxytropiskansuensisBunge)等藥用植物中分離獲得能產(chǎn)生宿主具有的喜樹堿[14]、長春新堿[15]、石杉堿甲[16]、金絲桃素[17]、鬼臼毒素[18]、西貝母堿[19]、綠原酸[20]、龍膽苦苷[21]和苦馬豆堿[22-23]等成分的內(nèi)生真菌菌株[24]。此外，內(nèi)生真菌還能夠產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物。由于內(nèi)生真菌生物多樣性高，其次生代謝產(chǎn)物也是一個巨大的天然產(chǎn)物資源庫，因此，內(nèi)生真菌是許多重要藥用成分的新來源。

為探索甘油三油酸酯(triolein)工廠化生產(chǎn)的新途徑、擴大其資源基礎(chǔ)，作者以分離自薏苡的內(nèi)生真菌GibberellamoniliformisAH13為研究對象，對其適宜培養(yǎng)基進行篩選，以期為triolein的人工發(fā)酵生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試內(nèi)生真菌GibberellamoniliformisAH13[5]分離自薏苡，該菌種的ITS序列已提交GenBank(登錄號為KF775590)，并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為AF2013030，4 ℃斜面保存。

主要儀器和試劑：HYG-A全溫搖瓶柜(太倉市實驗設(shè)備廠)；LC-2010A-HT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SEDEX 80 ELSD蒸發(fā)光散射器(法國Sedere公司)；LCQ Deca XP MAX離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Finnigan公司)，配有標準電噴霧離子源(ESI)和大氣壓大氣壓力化學電離子源(APCI)，分析軟件為MassHunter在線工作站和Qualiative Analysis離線分析軟件；KQ5200B型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；XTP-7000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；DFY-500型高速重要粉碎機(上海鼎廣機械設(shè)備有限公司)；AL104型電子天平〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕；ZORBAX SB-C18色譜柱(美國Agilent公司)。Triolein標準品(純度大于99%)購自美國Sigma公司；主要試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)triolein的液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及培養(yǎng)體系優(yōu)化參照Jia等[5]的方法、分別采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、薏苡仁培養(yǎng)基(Adlay)、大米培養(yǎng)基(Rice)、MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基對G.moniliformisAH13菌株進行液體培養(yǎng)；采用下述方法分別測定不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中triolein的含量，據(jù)此篩選出triolein產(chǎn)量最高的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

以triolein產(chǎn)量最高的Rice培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對培養(yǎng)體系參數(shù)進行優(yōu)化。用質(zhì)量濃度0、5、10、15、20、25和30 g·L-1的Rice培養(yǎng)基對G.moniliformisAH13菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，并按照下述方法測定發(fā)酵產(chǎn)物中triolein含量，據(jù)此篩選出triolein產(chǎn)量最高的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 質(zhì)譜和色譜分析條件 高效液相色譜串聯(lián)大氣壓化學電離源質(zhì)譜(HPLC-APCI-MS)條件：正離子檢測模式，噴霧電壓3 000 V，毛細管溫度250 ℃，大氣壓電離源溫度400 ℃，corona電流4 μA，鞘氣(高純液氮)壓力35 kPa。質(zhì)譜掃描范圍300～900 amu，掃描時間1 s，Q1寬度0.7。高效液相色譜(HPLC)條件： Discovery C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流動相為乙腈-二氯甲烷(體積比66∶34)混合溶液1 000 mL；流速0.7 mL·min-1；柱溫30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器；漂移管溫度45 ℃；氮氣流速1.5 L·min-1，進樣量10 μL。

1.2.3 對照品溶液的配制和分析 精密稱取0.035 6 g triolein標準品，用乙腈-二氯甲烷(體積比66∶34)混合溶液溶解并定容至25 mL，配成質(zhì)量濃度1.424 mg·mL-1的trolein對照品溶液。按照上述質(zhì)譜和色譜分析條件進行分析。

1.2.4 樣品溶液的制備和分析 精密稱定G.moniliformisAH13發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物粉末0.6 g(過100目篩)，用乙腈-二氯甲烷(體積比66∶34)混合溶液溶解并定容至50 mL，稱定質(zhì)量；浸泡2 h后超聲處理30 min，冷卻后稱定質(zhì)量；用乙腈-二氯甲烷(體積比66∶34)混合溶液補足損失的質(zhì)量，混勻后依次用濾紙和微孔濾膜(0.45 μm)過濾，濾液即為樣品溶液。按照上述質(zhì)譜和色譜分析條件進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法根據(jù)標準品的峰面積計算樣品中的triolein含量。

2 結(jié)果和分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

分別用PDB、Adlay、Rice、MS和B5培養(yǎng)基對G.moniliformisAH13菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果顯示：PDB、Adlay和Rice培養(yǎng)液的產(chǎn)物中均含有triolein，triolein含量分別為10.27、87.48和152.65 μg·mL-1；而MS和B5培養(yǎng)液中均未檢測出triolein。因Rice培養(yǎng)液中triolein含量最高，故可初步確定Rice培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌G.moniliformisAH13產(chǎn)triolein的發(fā)酵培養(yǎng)較為適宜。

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用不同質(zhì)量濃度的Rice培養(yǎng)基對G.moniliformisAH13菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)物中triolein含量的測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明：隨Rice培養(yǎng)基質(zhì)量濃度的提高(5～30 g·L-1)，triolein含量逐步提高。其中質(zhì)量濃度30 g·L-1的Rice培養(yǎng)基中triolein含量最高，分別是5、10、15、20和25 g·L-1Rice培養(yǎng)基中triolein含量的2.21、1.58、1.44、1.30和1.14倍。表明質(zhì)量濃度30 g·L-1Rice培養(yǎng)基是G.moniliformisAH13菌株產(chǎn)triolein發(fā)酵培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表1 不同質(zhì)量濃度大米培養(yǎng)基對薏苡內(nèi)生真菌GibberellamoniliformisAH13發(fā)酵產(chǎn)物中triolein含量的影響

Table 1 Effect of Rice medium with different mass concentrations on triolein content in fermentation product of endophytic fungiGibberellamoniliformisAH13 inCoixlacryma-jobiLinn.

培養(yǎng)基質(zhì)量濃度/g·L-1Massconcentrationofmediumtriolein含量/μg·mL-1Contentoftriolein 0(CK)0．005 96．8210 135．3115 148．9720 164．1825 186．7130 213．79

3 討論和結(jié)論

本研究結(jié)果表明：在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、薏苡仁培養(yǎng)基(Adlay)和大米培養(yǎng)基(Rice)中，內(nèi)生真菌G.moniliformisAH13均能產(chǎn)生triolein，其中在Rice培養(yǎng)基中triolein含量最高(為152.65 μg·mL-1)，而在B5和MS培養(yǎng)基中G.moniliformisAH13不能產(chǎn)生triolein。這可能是由于B5和MS培養(yǎng)基不能為G.moniliformisAH13提供合成triolein所需的底物，而PDB、Adlay和Rice培養(yǎng)基則能滿足G.moniliformisAH13合成triolein所需的底物和營養(yǎng)成分。綜合研究結(jié)果表明：30 g·L-1Rice培養(yǎng)基適宜于薏苡內(nèi)生真菌G.moniliformisAH13產(chǎn)triolein的發(fā)酵培養(yǎng)。

碳源是微生物合成油脂必需的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，常用的碳源有糖類、油脂、有機酸和低碳醇，蛋白質(zhì)和氨基酸也可用作碳源。Rice培養(yǎng)基的有機碳源為大米，具有含氮少、疏松、表面積大等特點，是較好的孢子培養(yǎng)基，可以供真菌孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體粗壯，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量；而PDB和Adlay培養(yǎng)基中的馬鈴薯和薏苡仁也均富含有機碳源及其他各種營養(yǎng)成分，因而對G.moniliformisAH13合成triolein也有一定的促進作用。但這些培養(yǎng)基中與triolein合成相關(guān)的關(guān)鍵成分還需進一步研究確定。

[1] 劉應(yīng)泉, 譚供根. 油脂與健康[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1989: 206.

[2] CHANG H C, HUANG Y C, HUANG W C. Antiproliferative and chemopreventive effects of adlay seed on lung cancerinvitroandinvivo[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 3656-3660.

[3] WOO JH, LID, WILSBACHK, et al.Coixseedextract, a commonly used treatment for cancer in China, inhibits NFkappaB and protein kinase C signaling[J]. Cancer Biology Therapy, 2007, 6: 2005-2011.

[4] 史周印, 李天曉, 王秋萍, 等. 薏苡仁注射液在中晚期肝癌化療栓塞中的應(yīng)用研究[J]. 腫瘤, 2001, 21(3): 233-234.

[5] JIA M, MING Q L, ZHANG Q Y, et al.GibberellamoniliformisAH13 with antitumor activity, an endophytic fungus strain producing triolein isolated from adlay (Coixlacryma-jobi: Poaceae)[J]. Current Microbiology, 2014, 69: 381-387.

[6] 苗明三. 薏苡仁多糖對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 中醫(yī)藥學報, 2002, 30(5): 49-50.

[7] 徐梓輝, 周世文, 黃林清. 薏苡仁多糖的分離提取及其降血糖作用的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2000, 22(6): 578-581.

[8] 張云霞, 張麗微, 孫晶波. 薏苡仁醇提物的降糖作用研究[J]. 中國中醫(yī)藥雜志, 2007, 5(8): 65-66.

[9] 高 嵐, 張仲一, 張 莉, 等. 薏苡仁湯鎮(zhèn)痛消炎作用的實驗研究[J]. 天津中醫(yī)學院學報, 2005, 24(1): 17-19.

[10] YEH P H, CHIANG W, CHIANG M T, et al. Effects of dehulled adlay on plasma glucose and lipid concentrations in streptozotocin-induced diabetic rats fed a diet enriched in cholesterol[J]. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 2006, 76: 299-305.

[11] YANG R S, CHIANG W, LU Y H, et al. Evaluation of osteo-porosis prevention by adlay using a tissue culture model[J]. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 2008, 17: 143-146.

[12] STIERLE A, STROBEL G, STIERLE D, et al. Taxol and taxane production byTaxomycesandreanae, an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science, 1993, 260: 214-216.

[13] ZHOU X W, ZHU H F, LIU L, et al. A review: recent advances and future prospects of taxol-producing endophytic fungi[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86: 1707-1717.

[14] PU X, QU X X, CHEN F, et al. Camptothecin-producing endo-phytic fungusTrichodermaatrovirideLY357: isolation, identifica-tion, and fermentation conditions optimization for camptothecin production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97: 9365-9375.

[15] YIN H, SUN Y H. Vincamine-producing endophytic fungus isolated fromVincaminor[J]. Phytomedicine, 2011, 18: 802-805.

[16] WANG Y, ZENG Q G, ZHANG Z B, et al. Isolation and char-acterization of endophytic huperzine A-producing fungi fromHuperziaserrata[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2011, 38: 1267-1278.

[17] KUSARI S, LAMSH?FT M, ZüHLKE S, et al. An endophytic fungus fromHypericumperforatumthat produces hypericin[J]. Journal of Natural Products, 2008, 71: 159-162.

[18] EYBERGER A L, DONDAPATI R, PORTER J R, et al. Endo-phyte fungal isolates fromPodophyllumpeltatumproduce podophyllotoxin[J]. Journal of Natural Products, 2006, 69: 1121-1124.

[19] YIN H, CHEN J L. Sipeimine-producing endophytic fungus isolated fromFritillariaussuriensis[J]. Zeitschrift Für Naturforschung C, 2008, 63: 789-793.

[20] CHEN X M, SANG X X, LI S H, et al. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated fromEucommiaulmoidesOliver[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2010, 37: 447-454.

[21] YINH,ZHAOQ,SUNFM,etal. Gentiopicrin-producing endophytic fungus isolated fromGentianamacrophylla[J]. Phytomedicine, 2009, 16: 793-797.

[22] COOK D, GARDNER D R, RALPHS M H, et al. Swainsoninine concentrations and endophyte amounts ofUndifilumoxytropisin different plant parts ofOxytropissericea[J]. Journal of Chemical Ecology, 2009, 35: 1272-1278.

[23] YU Y, ZHAO Q, WANG J, et al. Swainsonine-producing fungal endophytes from major locoweed species in China[J]. Toxicon, 2010, 56: 330-338.

[24] ZHAOJ,SHANT,MOUY,etal.Plant-derivedbioactive compounds produced by endophytic fungi[J]. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2011, 11: 159-168.

(責任編輯: 張明霞)

Screening on fermentation medium of endophytic fungiGibberellamoniliformisAH13 producing triolein fromCoixlacryma-jobi

WEN Xian1,2, CHENG Nuo2, HAN Ting2, CHEN Guilin1,2, JIA Min2,①, QIN Luping2,①

(1. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China; 2. Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 118-120

Fermentation medium of endophytic fungiGibberellamoniliformisAH13 producing triolein fromCoixlacryma-jobiLinn. was screened. The results show that fermentation products ofG.moniliformisAH13 in potato dextrose liquid medium (PDB),C.lacryma-jobiseed medium (Adlay) and rice medium (Rice) all containtrioleinwithcontentsof 10.27, 87.48 and 152.65 μg·mL-1, respectively, while that in MS medium and B5medium does not contain triolein. It is indicated that Rice medium is suitable for fermentation culture ofG.moniliformisAH13 to produce triolein. With enhancing of mass concentration (5-30 g·L-1) of Rice medium, triolein content in fermentation product increases gradually and it is the highest (213.79 μg·mL-1) in 30 g·L-1Rice medium. It is suggested that 30 g·L-1Rice medium is the suitable medium for fermentation culture ofG.moniliformisAH13 inC.lacryma-jobito produce triolein.

薏苡; 內(nèi)生真菌;GibberellamoniliformisAH13; 甘油三油酸酯; 培養(yǎng)基篩選

Coixlacryma-jobiLinn.; endophytic fungi;GibberellamoniliformisAH13; triolein; medium screening

2014-12-08

文 先(1990—)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，主要從事藥用植物化學方面的研究。

①通信作者E-mail: jm7.1@163.com; qinluping@126.com

Q939.9; Q948.12+2.3

A

1674-7895(2015)03-0118-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.18