王 勇，王顯雷，劉 銳，黃新莉，陳素麗，李衛(wèi)紅

·論著·

硫化氫對脂多糖致急性肺損傷大鼠的保護作用及其作用機制研究

王 勇，王顯雷，劉 銳，黃新莉，陳素麗，李衛(wèi)紅

目的 探討硫化氫(H2S)對脂多糖(LPS)致急性肺損傷(ALI)大鼠的保護作用及其作用機制。方法 選取清潔級健康雄性SD大鼠30只，隨機分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組10只。對照組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液0.5 ml/kg舌下靜脈注射，模型組大鼠給予LPS 5 mg/kg舌下靜脈注射，干預(yù)組大鼠給予LPS 5 mg/kg舌下靜脈注射，并在注射LPS前15 min給予NaHS 28 μmol/kg腹腔注射。檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白及白介素10(IL-10)含量、肺組織細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達情況。結(jié)果 模型組、干預(yù)組大鼠BALF蛋白及IL-10含量、肺組織ICAM-1水平高于對照組，干預(yù)組大鼠BALF蛋白及IL-10含量、肺組織ICAM-1水平低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 H2S對LPS致ALI有一定的保護作用，其作用機制可能與降低肺內(nèi)IL-10含量、減少肺組織ICAM-1表達關(guān)。

急性肺損傷；硫化氫；脂多糖；白介素10；細(xì)胞間黏附分子1；大鼠，Sprague-Dawley

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由休克、創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染等因素導(dǎo)致的彌漫性肺實質(zhì)損傷，ALI患者機體內(nèi)可產(chǎn)生多種炎性遞質(zhì)，同時伴有眾多炎性細(xì)胞因子和黏附分子的過度表達。ALI致病因素多且病死率高，但目前其發(fā)病機制仍未完全闡明[1-3]。研究表明，ALI患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)被激活并聚集，繼而釋放氧自由基和蛋白水解酶等，導(dǎo)致肺微血管通透性增高；白介素10(IL-10)可能通過抑制氣道炎癥來延緩ALI的發(fā)展；抑制細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達可有效減輕ALI患者體內(nèi)炎性反應(yīng)[4-7]。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后被發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號分子，具有舒張血管、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖/凋亡等作用[8]。本研究旨在探討H2S對脂多糖(LPS)致大鼠ALI的保護作用及對肺組織ICAM-1表達的影響，為臨床防治ALI提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 NaHS(美國Sigma公司)，LPS(E.coli 0111：B4)，IL-10檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗ICAM-1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，石蠟切片機(Leica RM2235，德國Leica公司)，光學(xué)顯微鏡(北京麥克奧迪儀器儀表有限公司)，電子天平(AE240型，日本METTLER)，低溫離心機(EBA12R型，德國Hettich公司)，VIS-7220可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器公司)等。

1.2 動物分組及模型制備 選取清潔級健康雄性SD大鼠30只(由河北省實驗動物中心提供)，體質(zhì)量210～240 g，放于籠底覆蓋潔凈墊料的鼠籠內(nèi)，并給予充足的飼料和水，籠內(nèi)溫度24 ℃左右，相對濕度40%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～4 d后隨機分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組10只。對照組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液0.5 ml/kg舌下靜脈注射，模型組大鼠給予LPS 5 mg/kg舌下靜脈注射，干預(yù)組大鼠給予LPS 5 mg/kg舌下靜脈注射，并在注射LPS前15 min給予NaHS 28 μmol/kg腹腔注射。本研究中對所有大鼠進行的操作符合動物實驗倫理要求。

1.3 肺組織病理學(xué)改變 所有大鼠于造模成功6 h后處死，取部分左肺組織，采用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度5 μm)；采用HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白及IL-10含量檢測 各組小鼠開胸后結(jié)扎左肺，經(jīng)氣管注入預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液5 ml并進行支氣管肺泡灌洗，重復(fù)3次收集BALF；3 000 r/min離心10min，吸取上清液，采用改良酚試劑法檢測BALF蛋白含量；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BALF IL-10含量。所有檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5 肺組織ICAM-1的表達 取各組大鼠部分右肺組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化；采用兔抗ICAM-1多克隆抗體(1∶100)作為一抗，37 ℃孵育1.5 h；采用免疫組化染色，以光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為ICAM-1表達陽性；采用PBS代替一抗作為陰性對照，ICAM-1的表達水平以平均光密度(OD)值表示。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠肺組織正常，肺泡壁??；模型組大鼠肺組織嚴(yán)重受損，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤；干預(yù)組大鼠肺組織損傷程度較輕，肺泡間隔較厚，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(見圖1)。

2.2 BALF蛋白及IL-10含量 3組大鼠BALF蛋白及IL-10含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組、干預(yù)組大鼠BALF蛋白及IL-10含量高于對照組，干預(yù)組大鼠BALF蛋白及IL-10含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 肺組織ICAM-1的表達 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠肺組織無或有少量棕黃色顆粒；模型組大鼠肺組織有大量棕黃色顆粒，主要見于氣道黏膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；干預(yù)組大鼠肺組織有少量棕黃色顆粒(見圖2)。3組大鼠肺組織ICAM-1表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組、干預(yù)組大鼠肺組織ICAM-1表達水平高于對照組，干預(yù)組大鼠肺組織ICAM-1表達水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of protein and IL-10 levels of BALF，ICAM-1 expression of lung tissue among the three groups

組別只數(shù)BALF蛋白含量(mg/L)BALFIL-10含量(ng/L)肺組織ICAM-1表達水平(OD值)對照組1032.99±6.8919.64±1.720.16±0.05模型組1094.98±12.95a63.09±11.28a0.36±0.07a干預(yù)組1069.71±9.67ab50.72±4.14ab0.26±0.11abF值95.240102.07223.328P值<0.05<0.05<0.05

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討論

ALI是多種原因引起的、以過度炎性反應(yīng)和高代謝為特征的急性彌漫性肺泡和肺血管損傷，可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress sydrome，ARDS)。ALI患者體內(nèi)多種炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等)在肺部大量聚集、過度激活，繼而釋放大量炎性遞質(zhì)或炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，參與炎性反應(yīng)；同時機體會分泌多種抗炎性細(xì)胞因子來維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，包括IL-4、IL-10、IL-13等；促炎因子與抗炎因子嚴(yán)重失衡將進一步放大和加強損害信號，繼而形成炎癥瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致肺泡彌漫性損害、毛細(xì)血管通透性增高、蛋白滲出、肺間質(zhì)水腫等[9-10]。研究表明，造成ALI 的主要病因是細(xì)菌內(nèi)毒素，其中以革蘭陰性菌內(nèi)毒素為主，而革蘭陰性菌內(nèi)毒素的主要活性成分為LPS。本研究通過舌下靜脈注射LPS 5 mg/kg制備ALI大鼠模型，6 h后處死，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織嚴(yán)重受損，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，BALF蛋白含量高于對照組，說明采用舌下靜脈注射LPS成功制備了ALI大鼠模型。

注：A為對照組，B為模型組，C為干預(yù)組

圖1 3組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色，×400)

Figure 1 Pathological changes of lung tissue among the three groups

注：A為對照組，B為模型組，C為干預(yù)組

H2S是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的第3種內(nèi)源性氣體信號分子，不僅可在生理條件下參與機體調(diào)節(jié)活動，還可參與多種疾病的病理過程。內(nèi)源性H2S主要由含硫氨基酸(L-半胱氨酸)經(jīng)多種酶促反應(yīng)產(chǎn)生，在體內(nèi)以2種形式存在，即未溶解的氣體H2S(約占1/3)和NaHS(約占2/3)。NaHS是常用的外源性H2S供體，其在體內(nèi)可分解為Na+和HS-，后者與體內(nèi)H+結(jié)合可生成H2S，正常生理條件下，體內(nèi)H2S與NaHS保持動態(tài)平衡[11]。研究表明，H2S在多種肺疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺炎癥性損傷及肺纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，肺疾病患者體內(nèi)H2S含量低于健康人[12-16]，給予H2S供體NaHS或吸入低劑量H2S能夠明顯改善患者肺組織損傷嚴(yán)重程度[17-18]。由于NaHS溶液穩(wěn)定性較好，因此常作為H2S供體而用于相關(guān)干預(yù)實驗[4]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠肺組織損傷程度較輕，肺泡間隔較厚，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤，BALF蛋白含量低于模型組,提示H2S可有效減輕ALI大鼠炎性反應(yīng)程度，降低肺微血管通透性，減少蛋白滲出，從而保護肺組織。

研究表明，ALI患者體內(nèi)細(xì)胞因子大量釋放，促炎因子與抗炎因子同時存在，而促炎因子與抗炎因子失衡是導(dǎo)致ALI加重并發(fā)展為ARDS的重要作用機制之一。IL-10又稱細(xì)胞因子合成抑制因子，是一種內(nèi)源性抗炎因子，主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對免疫應(yīng)答起抑制作用。研究表明，IL-10是肺內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，在維持肺穩(wěn)態(tài)和抗炎調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，IL-10主要通過抑制JAK/STAT信號通路和NF-κB信號通路而發(fā)揮強大的抗炎作用和免疫抑制作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示，模型組、干預(yù)組大鼠BALF IL-10含量高于對照組，干預(yù)組大鼠BALF IL-10含量低于模型組，說明IL-10參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展，H2S可能通過降低IL-10含量而糾正體內(nèi)促炎與抗炎因子的失衡，減輕炎性反應(yīng)嚴(yán)重程度。

ICAM-1是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞參與肺損傷的分子物質(zhì)，在ALI的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，可作為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的生物學(xué)標(biāo)志物，而抑制ICAM-1的表達能有效緩解ALI患者體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷[22-24]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織有大量棕黃色顆粒，且主要見于氣道黏膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，而干預(yù)組大鼠肺組織僅有少量棕黃色顆粒；模型組、干預(yù)組大鼠肺組織ICAM-1表達水平高于對照組，干預(yù)組大鼠肺組織ICAM-1表達水平低于模型組，提示H2S可能通過減少肺組織ICAM-1的表達而發(fā)揮抗ALI作用。

綜上所述，H2S對LPS致ALI大鼠有一定的保護作用，其可能通過降低肺內(nèi)IL-10含量、減少肺組織ICAM-1表達而減輕肺泡-毛細(xì)血管損傷及減少蛋白滲出，從而抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮抗ALI作用，有效保護肺組織。

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(本文編輯：鹿飛飛)

Protective Effect of Hydrogen Sulfide on LPS-induced Acute Lung Injury in Rats and Its Mechanism

WANGYong，WANGXian-lei，LIURui，etal.

DepartmentofTuberculosis，ChestHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050041，China

Objective To investigate the protective effect of hydrogen sulfide on LPS-induced acute lung injury in rats and its mechanism.Methods A total of 30 clean healthy male SD rats were selected and randomly divided into groups A，B，C，each of 10 rats.Rats of A group were given sublingual venous injection of 0.9% sodium chloride injection(0.5 ml/kg)，rats of B group were given sublingual venous injection of LPS(5 mg/kg)，rats of C group were given intraperitoneal injection of NaHS 28 μmol/kg before 15 minutes of sublingual venous injection of LPS(5 mg/kg).Protein level and IL-10 level of BALF，ICAM-1 level of lung tissue were detected.Results Protein level and IL-10 level of BALF，ICAM-1 level of lung tissue of groups B and C were statistically significantly higher than those of A group，and above index of C group were statistically significantly lower than those of B group(P<0.05).Conclusion Hydrogen sulfide has certain protective effect on LPS-induced acute lung injury，its mechanism is possibly related with decreasing of IL-10 level and ICAM-1 expression.

Acute lung injury；Hydrogen sulfie；Lipopolysaccharides；Interleukin-10；Intercellular adhesion molecule-1；Rats，Sprague-Dawley

河北省衛(wèi)生計生委指導(dǎo)性課題(20130436)

050041河北省石家莊市，河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科(王勇，王顯雷，劉銳，陳素麗，李衛(wèi)紅)；河北醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室(黃新莉)

王勇.王顯雷，劉銳，等.硫化氫對脂多糖致急性肺損傷大鼠的保護作用及其作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(8)：43-46.[www.syxnf.net]

R 332 R 563

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.08.013

2015-03-10；

2015-06-13)

Wang Y，Wang XL，Liu R，et al.Protective effect of hydrogen sulfide on LPS-induced acute lung injury in rats and its mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(8)：43-46.