焦海濤，王愛民，張宇新，李欣

(1．河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063009 2．承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000 3．河北省承德市中心醫(yī)院，河北承德 067000)

吉非替尼對(duì)敲低聯(lián)蛋白A 7的HepG 2細(xì)胞增殖的影響*

焦海濤1，2，王愛民3，張宇新1＊＊，李欣2

(1．河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063009 2．承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000 3．河北省承德市中心醫(yī)院，河北承德 067000)

目的:探討表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼對(duì)敲低膜聯(lián)蛋白A7后的人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖的影響，為肝癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:將細(xì)胞分為吉非替尼組、siRNA轉(zhuǎn)染、siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法靶向?qū)NXA7的siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后6h在siRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA轉(zhuǎn)染組+吉非替尼組加入一定濃度的吉非替尼，加藥后72h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)以檢測細(xì)胞增殖活力，從而計(jì)算增殖抑制率。結(jié)果:MTT檢測得知，siRNA轉(zhuǎn)染組、吉非替尼組和siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組，對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，較對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)論:吉非替尼對(duì)敲低ANXA7后的HepG2細(xì)胞的增殖具有更為明顯的抑制作用。

吉非替尼;膜聯(lián)蛋白A7;HepG2細(xì)胞;增殖抑制

肝癌是全球發(fā)病率排名第五的惡性腫瘤，目前沒有特效藥物能夠阻止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，嚴(yán)重影響肝癌患者的生存和預(yù)后［1］。近年來隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子靶向藥物在多種實(shí)體瘤中較為廣泛的應(yīng)用，使腫瘤治療的未來充滿希望。吉非替尼在臨床上已廣泛用于肺癌的治療，也有研究證實(shí)，吉非替尼能抑制肝癌細(xì)胞增殖［2～4］。膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7，ANXA7)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是一種能促進(jìn)膜融合的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在正常體外培養(yǎng)的情況下，敲低人肝癌HepG2細(xì)胞中ANXA7蛋白的表達(dá)量，該細(xì)胞的生長與增殖受到一定程度的抑制［5］。本研究將敲低人肝癌HepG2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)水平和吉非替尼相結(jié)合，觀察HepG2細(xì)胞增殖的變化，為改善肝癌的療效提供新的治療方式和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1．1 試劑和儀器設(shè)備:轉(zhuǎn)染試劑lipofectaminE2000 (1ipo2000)、靶向ANXA7的siRNA、MTT粉劑均為Invitrogen公司產(chǎn)品;ANXA7小鼠單克隆抗體購自美國sigma公司;DMEM為美國Gibco公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)購自北京博奧森生物科技有限公司;MK3酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱型號(hào)HERA-ceu150，為德國賀利公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)板購自北京華美公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物:人肝癌HepG2細(xì)胞由承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所提供，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中，置含5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。吉非替尼(Iressa)購自阿斯利康公司，250mg/片，分子式C22H24ClFN4O3，分子量為446，將吉非替尼用DMSO溶解，配制成20mM的溶液，－20℃冰箱儲(chǔ)存，用時(shí)常溫解凍后，用DMEM稀釋至所需濃度，并使DMSO的最終濃度不超過0．1%，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。

1．3 MTT法檢測吉非替尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響:收集對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)0．25%胰酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/孔，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液。分為陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組只加入培養(yǎng)液200μL，實(shí)驗(yàn)組加入含有不同濃度吉非替尼的培養(yǎng)液200μL，使吉非替尼終濃度分別0．01、0．1、0．5、1．0、5．0、10．0、50．0μM;繼續(xù)培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT20μL(5mg/ mL)，置37℃、5%CO2避光繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，震蕩10min后于酶標(biāo)儀上測OD值(波長=490nm)。并按照以下公式計(jì)算各濃度藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率:平均細(xì)胞抑制率IR=(1－用藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長抑制圖，應(yīng)用直線回歸法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1．4 吉非替尼對(duì)抑制膜聯(lián)蛋白A7后的HepG2細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響

1．4．1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將培養(yǎng)于60mm細(xì)胞培養(yǎng)板中的HepG2細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1d按4×104/孔種于6孔板中，使細(xì)胞密度在24h內(nèi)達(dá)到70%以內(nèi)。將細(xì)胞分為siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組和吉非替尼處理組。配置體積為250μL的無血清DMEM與siRNA寡核苷酸的混合物，其中包含30pmoL/L siRNA寡核苷酸，輕柔混勻，室溫放置5min后與Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑混合，再在室溫放置20min，然后將混合物分別加至所需要的培養(yǎng)孔中。轉(zhuǎn)染后6h換液，空白對(duì)照組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組換為含血清的DMEM，吉非替尼處理組，siRNA轉(zhuǎn)染加吉非替尼處理組換為吉非替尼終濃度為5μM含血清的DMEM。

1．4．2 MTT實(shí)驗(yàn):各組細(xì)胞用0．25%胰酶消化細(xì)胞，以1×105/孔的密度種96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染方法和轉(zhuǎn)染后處理如前。72h后，每組分別加入20μL (5mg/mL)MTT后，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后取出小心吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩10min，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率。

1．4．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組之間比較采用單因素方差分析，組間變量比較采用q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 吉非替尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用:MTT結(jié)果顯示，不同濃度的吉非替尼作用于HepG2細(xì)胞72h后有顯著差異，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的相對(duì)抑制率也相應(yīng)提高，當(dāng)吉非替尼的用量升高至5μM時(shí)，細(xì)胞增殖的抑制率接近50%，如圖1所示。

圖1 72h不同濃度梯度吉非替尼對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖的改變(*:P＜0．05，＊＊:P＜0．01)

圖2 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖的改變(*:P＜0．05，*＊:P＜0．01)

2．2 吉非替尼對(duì)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞的作用:分別對(duì)各組的OD值進(jìn)行分析顯示:siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組和吉非替尼組OD值明顯低于吉非替尼轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照和空白對(duì)照組細(xì)胞，說明siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組和吉非替尼組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組的抑制作用最為顯著(p＜0．01)。吉非替尼轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照和空白對(duì)照組之間無明顯差異(P＞0．05)，見圖2。

3 討論

肝癌僅次于胃癌，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中排名第二。其惡性度極高、預(yù)后極差，術(shù)后生存期短、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此，重視肝癌治療的基礎(chǔ)研究，結(jié)合臨床需要，探索發(fā)現(xiàn)與肝癌治療相關(guān)的、有效的分子靶向藥物成為近年來研究的熱點(diǎn)。

吉非替尼(Gefitinib)是近年發(fā)現(xiàn)的一種小分子選擇性表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，能選擇性抑制ATP與受體酪氨酸激酶的結(jié)合，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖和生存信號(hào)的傳導(dǎo)，同時(shí)也有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤血管生成的作用。吉非替尼在臨床上已廣泛用于接受過一線化療效果不好或不適宜采用化療的晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCL)患者［6］。EGFR在多惡性腫瘤組織中存在過度表達(dá)，其中就包括肝癌，而且EGFR已被證實(shí)是低分化的HCC患者腫瘤早期復(fù)發(fā)、預(yù)后不良的因素之一，在此基礎(chǔ)上的研究證實(shí)，吉非替尼在體外正常培養(yǎng)下，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞已顯示出增殖抑制作用。

膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族之中的一員，ANXA7涉及促進(jìn)嗜鉻細(xì)胞顆粒膜的結(jié)合、聚集、融合和鈣離子動(dòng)態(tài)平衡等多種生物學(xué)功能。ANXA7在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，如乳腺癌和宮頸鱗癌組織中表達(dá)增高，而在前列腺癌和胃癌組織中表達(dá)降低，由于其表達(dá)的差異性很強(qiáng)而被認(rèn)為是前列腺癌、乳腺癌、胃癌等診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。ANXA7編碼基因位于10號(hào)染色體上，該染色體結(jié)合位點(diǎn)含多個(gè)與腫瘤有關(guān)的抑癌基因，因此ANXA7被認(rèn)為是一個(gè)候選的抑癌基因，隨著研究的深入，在不同惡性腫瘤中的異常表達(dá)又使得ANXA7變得不能確定，它與不同腫瘤的聯(lián)系及相關(guān)機(jī)制還在繼續(xù)的探索之中。

在以上研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)吉非替尼單獨(dú)作用于HpeG2細(xì)胞，細(xì)胞的增殖受到了一定的抑制。而且王小杰等［5］研究表明敲低人肝癌HepG2細(xì)胞中ANXA7蛋白的表達(dá)，該細(xì)胞的生長與增殖受到一定程度的抑制。于是我們想證實(shí)一下對(duì)肝癌細(xì)胞分別有抑制作用的兩種因素，即分子靶向藥物吉非替尼和敲低ANXA7，如果將二者聯(lián)合應(yīng)用是否能協(xié)同抑制HpeG2細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼組、siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組對(duì)HpeG2細(xì)胞有明顯的抑制作用，且siRNA轉(zhuǎn)染+吉非替尼組的抑制效果要高于單因素組，對(duì)HpeG2細(xì)胞的增殖抑制作用更為顯著。由此我們推測，ANXA7與吉非替尼兩種處理因素可能存在協(xié)同作用，通過敲低ANXA7的表達(dá)可以增加HpeG2細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。關(guān)于二者協(xié)同作用的機(jī)制，還有待我們進(jìn)一步深入研究。

［1］El－Serag HB，Mason AC．Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States［J］．N Engl Med，1999，340: 745～750．

［2］何怡，王東，張沁宏，等．EGFR抑制劑吉非替尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28 (2):125～128．

［3］朱步東，袁守軍，徐建明，等．易瑞莎對(duì)H22肝癌小鼠的抑癌作用［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(8):684～686．

［4］郭桂英，石靜濱，陳鳳霞，等．吉非替尼對(duì)肝癌Bel7402細(xì)胞株放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中華腫瘤預(yù)防雜志，2011，18(11):844～850．

［5］王小杰，李欣．膜聯(lián)蛋白A7低表達(dá)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響［J］．解剖學(xué)報(bào)，2013，44(5):656～660．

［6］董強(qiáng)剛．上皮生長因子受體家族與肺癌的分子靶向治療［J］．腫瘤，2004，24(2):B93～95．

Effect of Gefitinib on Proliferation of the Annexin A7 Knockdown HepG2 Cell

JIAO Haitao，et al
(Basic Medical Sciences of Hebei United University，Hebei Tangshan 063009，China)

Objective:To explore the effect of EGFR inhibitor gefitinib on proliferation of the annexin A7 knockdown HepG2 cell，and to provide the evidence for potentialmolecular target therapy in the HCC clinical treatment．Method:The HepG2 cells were divided into gefitinib group，a siRNA transfection group，siRNA transfection combined gefitinib group，negative group and control group．The siRNA was transfected into HepG2 cells by lipofectamine transfection method．Six hours after transfection，added a certain concentration of gefitinib into siRNA transfection group and siRNA transfection combined gefitinib group．Seventy－two hours after adding gefitinib，MTT assay was used to detect proliferation activity，and calculation the cell proliferation inhibition rate．Result:MTT assay showed that proliferation of the group of siRNA transfection，gefitinib and siRNA transfection combined gefitinib decreased significantly(P＜0．05)．Conclusion:Gefitinib can inhibit proliferation of ANXA7 knockdown HepG2 cells．

Gefitinib;Annexin A7;HepG2 cells;Proliferation inhibition

B

10．3969/j．issn．1006－6233．2015．08．025

承德醫(yī)學(xué)院院級(jí)課題，(編號(hào):201218)

＊＊通訊作者

1006－6233(2015)08－1444－03