李德山，劉春香，姜媛媛，劉銘瑤，張瑛杰，袁清艷，郭笑辰，任桂萍，吳強(qiáng)，李婷婷（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱50030；.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，哈爾濱5005）

Anti-hEGFR輕、重鏈共表達(dá)及高表達(dá)細(xì)胞株快速篩選

李德山1，劉春香1，姜媛媛2，劉銘瑤1，張瑛杰1，袁清艷1，郭笑辰1，任桂萍1，吳強(qiáng)1，李婷婷1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，哈爾濱150025）

為實(shí)現(xiàn)hEGFR全長(zhǎng)抗體（anti-hEGFR）輕、重鏈共表達(dá)以及建立快速、高效篩選方法并獲得共表達(dá)細(xì)胞株。采用分子克隆技術(shù)獲得重鏈和輕鏈基因，將之連入peedual真核表達(dá)載體；經(jīng)GS-Neo加壓及流式細(xì)胞術(shù)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；通過(guò)proteinA親和層析技術(shù)純化出目標(biāo)抗體；應(yīng)用cck-8法、AnnexinV/PI法以及qPCR技術(shù)檢測(cè)anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞增殖、凋亡影響。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，純化后抗體純度為95.0%、分子質(zhì)量約為150 ku。cck-8試驗(yàn)中不同濃度anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞增殖均有極顯著抑制作用，且與商品化Cetuximab效果相近；anti-hEGFR與Cetuximab均可誘導(dǎo)A431細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，作用效果相近，均達(dá)極顯著。全長(zhǎng)抗體輕、重鏈的共表達(dá)，省去分別表達(dá)的重組過(guò)程，保證抗體天然結(jié)構(gòu)；GS-Neo雙加壓結(jié)合流式篩選，實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞株快速、高效分離；建立省時(shí)、高效抗體共表達(dá)平臺(tái)，為抗體類藥物真核構(gòu)建及篩選提供新思路。

anti-hEGFR；共表達(dá)載體；GS-Neo篩選；流式細(xì)胞術(shù)；抗腫瘤

表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長(zhǎng)因子（erbB）家族成員，具有酪氨酸激酶活性膜表面受體[1]，EGFR穩(wěn)定表達(dá)于許多上皮組織、間質(zhì)和神經(jīng)源性組織。不同器官發(fā)生的實(shí)體瘤也高表達(dá)EGFR，如頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和食管癌等[2]，Janani等研究發(fā)現(xiàn)，EGFR通過(guò)與相應(yīng)配體結(jié)合實(shí)現(xiàn)RAS/RAF/MEK/ ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩個(gè)通路間通過(guò)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行[3]。

目前，用于EGFR靶向性治療腫瘤的藥物主要有小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑和EGFR單克隆抗體（anti-hEGFR）兩類，藥物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移殺傷腫瘤細(xì)胞。一系列癌癥類型臨床揭示，接受小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑治療的患者中約有50%發(fā)生獲得性EGFR耐藥突變[4-5]?？贵w針對(duì)相應(yīng)抗原具有高特異性和高親和力特性，毒副作用較低，在疾病診斷和治療中有專一性。目前已上市抗腫瘤抗體藥物共20種，其中美國(guó)FDA批準(zhǔn)17個(gè)[6]。

原核生物不含蛋白加工修飾細(xì)胞器，因此，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)僅用于生產(chǎn)體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不需要糖基化的抗體片段如Fab、Fab'、scFv等[7]；低等真核生物表達(dá)系統(tǒng)，如酵母及絲狀真菌，可用于全長(zhǎng)抗體生產(chǎn)，但其糖基化類型與人類存在差異，此類型糖蛋白抗體半衰期較短、生理活性有限甚至對(duì)人體有毒性[8]。最接近于人體蛋白修飾的系統(tǒng)為哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以對(duì)蛋白進(jìn)行適當(dāng)折疊、裝配和翻譯修飾，在臨床應(yīng)用中占主導(dǎo)地位[9-10]。

抗體輕、重鏈同時(shí)表達(dá)并有效整合是載體構(gòu)建關(guān)鍵部分，高效篩選方法是蛋白藥物研發(fā)核心。本研究在載體中引入谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因，并在輕鏈下游插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因，在重鏈下游插入Neo基因，該方法不僅可保證輕、重鏈同時(shí)整合于表達(dá)細(xì)胞基因組，可通過(guò)兩種藥物加壓篩選并結(jié)合流式細(xì)胞儀分選，快速獲得高產(chǎn)細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株和載體

大腸桿菌E.coli DH5α，細(xì)胞株CHO-K1SV，真核表達(dá)載體Kozak-Pkappa、Pee6.4，Ires Neo均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心基因部保存；anti-EGFR抗體LC、HC由英濰捷基公司合成；皮膚鱗癌細(xì)胞株A431購(gòu)自ATCC；IRES-EGFP購(gòu)自美國(guó)Clontech，Pee12.4購(gòu)自Lonza；pMD18-T simple載體，購(gòu)自大連寶生物。

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA小提試劑盒，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SDS-PAGE相關(guān)試劑購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、G418購(gòu)自GIBCO公司；MSX、L-谷氨酰胺購(gòu)自Sigma Corporation；胰蛋白酶購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；GS supplement，HT supplement購(gòu)自Invitrogen；IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自M＆C corporation；cck-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶賽生物公司；Quantitative Real-time PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 引物

引物均由Invitrogen公司合成，序列見(jiàn)表1、2。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

真核表達(dá)載體peedual-anti-hEGFR由Pee12.4、Pee6.4、Kozak-Pkappa載體及anti-hEGFR重鏈和輕鏈、PIRES-Neo、PIRES-EGFP基因序列經(jīng)多步PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化得到。

1.2.2 細(xì)胞的電轉(zhuǎn)及陽(yáng)性細(xì)胞篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1SV細(xì)胞以1∶3濃度傳代，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至匯合度為70%～80%，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min后用PBS洗細(xì)胞一次，將細(xì)胞用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基稀釋計(jì)數(shù)，使?jié)舛冗_(dá)1×107個(gè)·mL-1。將20μg質(zhì)粒DNA加入400μL細(xì)胞懸液中，250 V、1 000Ω、1 000μF參數(shù)下電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)30 h后更換含GS、G418培養(yǎng)基加壓篩選，只有轉(zhuǎn)入該載體的細(xì)胞可以存活，待細(xì)胞長(zhǎng)至約90%后，用胰蛋白酶消化，PBS洗一次，再用PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀（購(gòu)自BD公司）分選。

1.2.3 Anti-hEGFR表達(dá)及純化

將未轉(zhuǎn)染空細(xì)胞及分選后陽(yáng)性細(xì)胞分別接種六孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，用PBS洗一次，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)約72 h后取培養(yǎng)上清，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清與標(biāo)準(zhǔn)品Cetuximab同時(shí)做SDS-PAGE分析。

表1 基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers for gene amplification

表2 qPCR引物Table 2 Primers for qPCR

收集約400 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用AKTA Purifier 100蛋白層析系統(tǒng)抗體純化。純化后蛋白用SDS-PAGE分析，并用紫外分光光度計(jì)（ND-1000型Spectrophotometer）測(cè)定濃度。

1.2.4 cck-8試驗(yàn)檢測(cè)anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞增殖影響

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A431細(xì)胞，用新鮮完全培養(yǎng)基將其稀釋至5×104個(gè)·mL-1后，按每孔100μL體積接種于96孔板（邊孔以培養(yǎng)基填充），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至匯合度為60%～70%。將anti-hEGFR及Cetuximab分別用無(wú)血清DMEM稀釋到3 000 ng·mL-1后，經(jīng)倍比稀釋直至最小濃度為93.75 ng·mL-1，將各濃度藥品依次加入接好的細(xì)胞中，此時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔、試驗(yàn)孔及標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)孔。72 h后取出培養(yǎng)板，向每孔中加入cck-8溶液10μL，將板放入培養(yǎng)箱中，培育1 h±10 min。使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（對(duì)照組OD均值-試驗(yàn)組OD均值）/對(duì)照組OD均值×100%

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Anti-hEGFR蛋白對(duì)A431細(xì)胞凋亡影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞以1～5×105個(gè)·mL-1濃度接種于六孔板，分三組，分別為Control、anti-hEGFR和Cetuximab組，24 h后將anti-hEGFR和Cetuximab分別以3 000 ng·mL-1濃度稀釋，加入試驗(yàn)組細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，檢測(cè)方法參見(jiàn)寶賽生物凋亡試劑盒說(shuō)明書。

1.2.6 qPCR技術(shù)檢測(cè)bax/bcl2 mRNA水平變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞以1～5×105個(gè)·mL-1濃度接種于六孔板，并分為三組，分別為Control、anti-hEGFR和Cetuximab組，24 h后將anti-hEGFR和Cetuximab以3 000 ng·mL-1濃度稀釋，加入試驗(yàn)組細(xì)胞中。48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin表達(dá)量作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)因子bax/bcl2相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 anti-hEGFR真核共表達(dá)載體構(gòu)建

該載體由pee6.4、pee12.4、Kozak-Pkappa真核表達(dá)載體及Ires EGFP、Ires Neo、anti-hEGFR的重鏈和輕鏈經(jīng)過(guò)多步酶切、PCR、連接、轉(zhuǎn)化而獲得。構(gòu)建成功載體如圖1所示。

圖1 peedual-anti-hEGFR真核共表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1 Profiles of peedual-anti-hEGFR eukaryotic co-expression vector

2.2 陽(yáng)性細(xì)胞株篩選

利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將peedual-anti-hEGFR真核共表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-K1SV細(xì)胞中，經(jīng)GS、G418加壓篩選結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選出穩(wěn)定、高效的表達(dá)anti-hEGFR細(xì)胞株（見(jiàn)圖2）。

2.3 Anti-hEGFR蛋白表達(dá)及純化

將空細(xì)胞及篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞分別用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)并收取上清，經(jīng)非還原性SDS-PAGE分析可見(jiàn)（見(jiàn)圖3A），空細(xì)胞不表達(dá)抗體，篩選到的細(xì)胞株可以表達(dá)抗體，大小與商品化的標(biāo)準(zhǔn)品Cetuximab相符。利用AKTA Purifier 100蛋白層析系統(tǒng)，通過(guò)proteinA親和層析技術(shù)純化出的全長(zhǎng)抗體純度約為95.0%（見(jiàn)圖3B）。

2.4 cck-8法檢測(cè)anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞抑制作用

cck-8檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖4）所示，與陰性對(duì)照組相比，不同濃度anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞均有抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），anti-hEGFR組與標(biāo)準(zhǔn)品相比，各濃度均差異不顯著。結(jié)果表明通過(guò)共表達(dá)方法獲得的anti-hEGFR對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)型腫瘤細(xì)胞A431具有明顯抑制作用。

圖2 陽(yáng)性細(xì)胞株分選Fig.2 Positive cells were identified and sorted by flow cytometry at 488 nm

2.5 Anti-hEGFR蛋白對(duì)A431細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

利用AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞總凋亡率為早期凋亡（Q2）與晚期凋亡（Q4）比率之和，結(jié)果（見(jiàn)圖5）可見(jiàn)，空白對(duì)照組凋亡率為12.0%，而anti-hEGFR組與Cetuximab組凋亡率分別為23.4%和23.6%，anti-hEGFR組與空白對(duì)照組相比促凋亡效果顯著（P＜0.01）。

2.6 anti-hEGFR對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平影響

圖3 anti-hEGFR的表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis the expression and purification of anti-hEGFR

圖4 cck-8法檢測(cè)anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.4 A431 cellinhibition caused by anti-hEGFR was determined with cck-8

圖5 anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞凋亡的作用Fig.5 Effectof anti-hEGFR on apoptosis of A431 cells

Bcl2、Bax的qPCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6，與空白對(duì)照組相比，anti-hEGFR組中Bcl2基因在mRNA水平上顯著降低（P＜0.05），Bax基因mRNA水平顯著提高（P＜0.01），而anti-hEGFR組與Cetuximab組相比無(wú)顯著差異。Bax的上調(diào)表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，同時(shí)Bcl2基因下調(diào)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，anti-hEGFR可以通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2、Bax表達(dá)促進(jìn)由EGFR通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖6 anti-hEGFR對(duì)A431細(xì)胞中Bcl2和Bax基因mRNA水平的影響Fig.6 Effect of anti-hEGFR on Bcl2 and Bax mRNA expression in A431 cells

3 討論與結(jié)論

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的抗體藥物多產(chǎn)自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cells，CHO），CHOK1SV細(xì)胞是可以懸浮生長(zhǎng)的谷氨酰胺合成酶（GS）缺陷型細(xì)胞，因此可以在表達(dá)載體上游加入GS基因作為篩選標(biāo)記，利用GS抑制物甲硫胺酸亞砜（L-Methionine sulfoxide，MSX）加壓篩選[11]；G418是一種氨基糖苷類抗生素，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)座子Tn601和n5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中最常用的抗性篩選劑[12]。由于GS及Neo篩選標(biāo)記不能直觀監(jiān)測(cè)及分選陽(yáng)性細(xì)胞，因此，本試驗(yàn)在輕鏈的下游引入EGFP基因，EGFP是GFP突變體，具有更高的熒光強(qiáng)度，在488 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光，進(jìn)而通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分選[13-15]；本試驗(yàn)在EGFP及Neo基因上游引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites，IRES），IRES來(lái)自腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV），能在真核細(xì)胞內(nèi)模擬mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，招募核糖體進(jìn)入并使其上游及下游的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子同時(shí)翻譯，被廣泛用于各類蛋白真核表達(dá)[16]。在陽(yáng)性細(xì)胞篩選過(guò)程中，多數(shù)只在載體構(gòu)建時(shí)引入單一篩選標(biāo)記，且只用一種篩選方法，使篩選時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)月甚至造成高表達(dá)細(xì)胞株丟失，最終無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果。

本試驗(yàn)對(duì)原有真核表達(dá)載體進(jìn)行改造，通過(guò)亞克隆方法獲得EGFR單克隆抗體輕、重鏈基因，并將之連入同一真核表達(dá)載體，從而保證抗體基因同時(shí)表達(dá)。EGFR單克隆抗體輕、重鏈的共表達(dá)避免分別表達(dá)后的重組過(guò)程，省去摸索最佳重組條件的時(shí)間，保持抗體天然活性，在抗腫瘤方面與商品化的Cetuximab有相近作用。多篩選標(biāo)記的加入使篩選工作可在一個(gè)月內(nèi)完成，節(jié)約共表達(dá)細(xì)胞株的篩選時(shí)間，加快研發(fā)進(jìn)程。該研究可為抗體的真核表達(dá)及細(xì)胞分選提供可靠方法，為抗體大量制備奠定基礎(chǔ)。

[1]Schroeder R L,Stevens C L,Sridhar J,et al.Small molecule tyrosine kinase inhibitors of ErbB2/HER2/Neu in the treatment of aggressive[J].Breast Cancer,2014,19(9):15196-15212.

[2]Mendelsohn J,Baselga J.Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer[J]. Journalof ClinicalOncology,2003,21(14):2787-2799.

[3]Ravi J,Sneh A,Shilo K,et al.FAAH inhibition enhances anandamide mediated anti-tumorigenic effects in non-small cell lung cancer by downregulating the EGF/EGFR pathway[J]. Oncotarget,2014,5(9):2475-2486.

[4]杜亞利,李瓊,等.皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體拮抗劑在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,35(3):99-102.

[5]Pao W,Miller V A,Politi K A,et al.Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated witha second mutation in the EGFR kinase domain[J].Plos Medicine, 2005,2(3):225-235.

[6]陳雪靜,常亮,高健.抗腫瘤抗體藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2015,28(1)∶84-90.

[7]劉東海,張更榮,張樂(lè)鳴,等.人神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基cDNA的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國(guó)病理生理雜志,2002,5:39-42.

[8]Gerngross T U.Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi[J].Nature Biotechnology, 2004,22(11):1409-1414.

[9]Wurm F M.Production of recombinant protein therapeutics in cultivatedma mamalian cells[J].Nat Biotechnol,2004,22(11): 1393-1398.

[10]Conradt H S,Nitmz M,Dittmar K E,et al.Expression of humaninterleukin-2 in recombinant baby hamster kidney,Ltk-,and Chinese ovary cells.tructure of O-linked carbohydrate chains and their location within the polypeptide[J].J Biol Chem,1989,264 (29):17368-17373.

[11]de la Cruz Edmonds MC,Tellers M,Chan C,et al.Development of transfection and high-producer screening protocols for the CHOK1SV cell system[J].Molecular Biotechnology,2006,34(2): 179-190.

[12]蔣玲琳,劉麗,朱含章,等.穩(wěn)定表達(dá)GlyRα1的HEK293細(xì)胞系的建立[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,27(7):64-650.

[13]鄧超,黃大昉,宋福平.綠色熒光蛋白及其應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2011,31(1):96-102.

[14]宋軍,王振坤,孔慶然,等.利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬胚胎的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39 (3):64-69.

[15]李璐,劉向宇,李德山.應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選中性粒細(xì)胞的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(4):52-55.

[16]Bochkov Y A,Palmenberg A C.Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependentupon IRES sequence and gene location[J].Bio Techniques,2006,41(3):283-288.

Co-expression of anti-hEGFR light and heavy chain and rapid screening of cell lines

LI Deshan1,LIU Chunxiang1,JIANG Yuanyuan2,LIU Mingyao1, ZHANG Yingjie1,YUAN Qingyan1,GUO Xiaochen1,REN Guiping1,WU Qiang1,LI Tingting1
(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin PharmaceuticalGroup Technology Center,Harbin 150025,China)

The aim of this study was to co-express hEGFR fulllength antibody(anti-hEGFR)light and heavy chains,also to establish a rapid screening method and obtain co-expressing cell lines.fulllength heavy chain and light chain were connected to peedual eukaryotic expression vector,which cloned by molecular cloning techniques.stably expressing cell lines were screened by GS-Neo pressure combining flow cytometry;the target antibody was purified by proteinA affinity chromatography;To validate the influence for cell proliferation and apoptosis of anti-hEGFR,cck-8 assay, AnnexinV/PImethod and qPCR were applicated to A431 cell.SDS-PAGE showed that molecular weight ofanti-hEGFR was about150 ku and relative purity was 95.0%.In cck-8 assay,the proliferation ofA431 cells were significantly inhibited,and anti-hEGFR had similar effects with Cetuximab.anti-hEGFR hadthe same effect with Cetuximab in terms of pro-apoptotic of A431 cells.Co-expression could eliminate the refolding process and ensure the activity;The method of GS-Neo pressure combining flow cytometry could achieve a fast and efficient separation of positive celllines;In this study,the province and efficient co-expression platform was established,which could offer new ideas for the production of antibody drugs.

anti-hEGFR;co-expression vector;GS-Neo screening;flow cytometry;anti-tumor

Q816

A

1005-9369（2015）10-0056-07

時(shí)間2015-10-28 16:14:39[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151028.1614.040.html

李德山,劉春香,姜媛媛,等.Anti-hEGFR輕、重鏈共表達(dá)及高表達(dá)細(xì)胞株快速篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(10):56-62.

Li Deshan,Liu Chunxiang,Jiang Yuanyuan,et al.Co-expression of anti-hEGFR light and heavy chain and rapid screening ofcelllines[J].Journalof NortheastAgriculturalUniversity,2015,46(10):56-62.(in Chinese with English abstract)

2015-02-11

國(guó)家自然基金東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)理科基地科研訓(xùn)練及科研能力提高項(xiàng)目（J1210069/J0116）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（GC13C104）

李德山（1950-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)制藥。E-mail:deshanli@163.com