高楊 王偉 劉英姿 陶強(qiáng) 萬(wàn)雪 張娟琨

(天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

1 引言

金霉素(Chlortetracyline，CTC)屬四環(huán)素類(lèi)光譜抗生素的一種，可由鏈霉菌培養(yǎng)液中提取出或以半合成方法生產(chǎn)，能夠有效抑制革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、立克次氏體等，抗菌范圍較廣。廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、禽畜疾病的預(yù)防與治療，添加于飼料中能夠增加禽畜日增重及飼料轉(zhuǎn)化率。但由于藥物濫用，殘留于動(dòng)物性食品中的金霉素對(duì)人體健康構(gòu)成了潛在的危害［1，2］。大部分國(guó)家對(duì)動(dòng)物性食品中金霉素的殘留做出了嚴(yán)格的限定。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB/T 22990-2008 和GB/T 5009.116-2003 規(guī)定了牛奶及畜、禽肉中金霉素殘留量，其中牛奶中最高限量為0.1 μg/mL。

目前，檢測(cè)金霉素的常用方法包括高效液相色譜法(HPLC)［3，4］、免疫分析法［5，6］、毛細(xì)血管電泳法［7］、微生物培養(yǎng)法［8］，其中，HPLC法雖然應(yīng)用最廣，檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)可靠，但對(duì)樣品純度要求較高，無(wú)法滿(mǎn)足大批量樣本快速篩查的需要;免疫分析法對(duì)樣品純度要求不高，但檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性差;毛細(xì)血管電泳法分析速度快，但靈敏度低;微生物培養(yǎng)法適合大量樣品篩選，但受抗菌活性雜質(zhì)的影響不適于定量分析。

分子印跡聚合物(MIPs)具有較強(qiáng)的特異性的分子識(shí)別能力，且耐高溫、高壓及酸堿腐蝕［9］，在制備不同功能的傳感器方面，已得到廣泛應(yīng)用［10，11］。由于兼具操作簡(jiǎn)便、造價(jià)低廉、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，基于電化學(xué)聚合法所制備的印跡膜傳感器近年來(lái)得到迅速發(fā)展［11～13］，所用的單體包括苯胺和吡咯等［14，15］。而以鄰氨基酚為單體，可在不同電極表面電聚合，膜厚度可控制在10 ～100 nm，且羥基作為潛在的配位位點(diǎn)，可進(jìn)一步提高傳感器的性能［16］。本研究采用循環(huán)伏安(CV)法，以鹽酸金霉素為模板分子，鄰氨基酚為聚合單體，構(gòu)建了測(cè)定鹽酸金霉素的分子印跡敏感膜電化學(xué)傳感器，與Guerreiro 等［17］制備的金霉素印跡聚合物膜離子選擇性電極相比，本傳感器具有更低的檢測(cè)下限，操作更簡(jiǎn)便。整個(gè)過(guò)程無(wú)需衍生化處理，響應(yīng)快，成本低，選擇性良好，可以滿(mǎn)足鹽酸金霉素痕量分析的要求，有望在食品檢測(cè)中得到更好的應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LK2005A 型電化學(xué)工作站(天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司);電化學(xué)測(cè)試采用三電極系統(tǒng)，玻碳電極為工作電極(GCE，Φ=4 mm)，鉑片電極為對(duì)電極，Ag/AgCl 電極為參比電極(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司);超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

鹽酸金霉素(Chlortetracycline，CTC，純度＞97%，上海生工生物工程有限公司)，配制成濃度為1 × 10-3mol/L 儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存，使用時(shí)逐級(jí)稀釋;其它試劑均為分析純;牛奶和雞肉購(gòu)于本地超市;實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 玻碳電極的預(yù)處理

將玻碳電極依次用1.0，0.30 和0.05 μm 粒度的α-Al2O3拋光粉研磨拋光，而后依次用HNO3(1 +1)無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗2 ～3 min，再將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍為-0.1 ～1.0 V，反復(fù)掃描直至得到陰、陽(yáng)極峰對(duì)稱(chēng)且穩(wěn)定的循環(huán)伏安(CV)圖為止，峰峰電位差在64mV 以下，取出電極待用。

2.3 分子印跡及非分子印跡修飾電極的制備

將0.1 g 鄰氨基酚(OAP)溶于0.1 mol/L HClO4中，并加入0.4 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至弱酸性(pH 5.5)，定容至250 mL(36.7 mmol/L)。從中移取9 mL，向其中加入1 mL 0.001 mol/L 鹽酸金霉素(CTC)，混合均勻。通N2除O2約15min，再將三電極系統(tǒng)浸入到含有CTC 和OAP 的NaClO4底液中，采用CV 法掃描30 圈，掃描電位為-0.2 ～1.2 V，掃描速度為50 mV/s，在玻碳電極表面得到電聚合膜，即制得含CTC 的聚合膜電極(CTC-MIP-POAP/GCE)。將玻碳電極浸入含有10mL 甲醇-0.5 mol/L H2SO4混合溶液(1∶4，V/V)洗脫24 h，二次蒸餾水淋洗1 min，得到留有CTC 分子構(gòu)型孔穴的分子印跡敏感膜(MIPPOAP/GCE)。在同樣條件下，制備不加入CTC 印跡分子的非印跡膜修飾電極(POAP/GCE)。

2.4 實(shí)際樣品分析

5 mL 牛奶置于50 mL 離心管，加入20 mL MCllvaine-EDTA 緩沖液及2 mL 三氯乙酸，漩渦混合2 min，在4 ℃下以4000 r/min 離心20 min，取上清液待用。稱(chēng)取5.00 g 切碎的肉樣置于50 mL 錐形瓶中，加入5% HClO4溶液25 mL，于振蕩器上振蕩提取10 min，移入離心管中，以2000 r/min 離心3 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，收集濾液待用。分別取兩份上清液及濾液2 mL，用PBS 分別稀釋至10 mL 作為樣品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 電化學(xué)制備分子印跡聚合膜

圖1A 為模版分子CTC 存在下玻碳電極上OAP 電聚合過(guò)程中的CV 曲線。由CV 曲線可見(jiàn)，OAP的電化學(xué)聚合是一個(gè)不可逆的過(guò)程。從掃描的第二圈開(kāi)始，電流便出現(xiàn)明顯的驟降，并隨著CV 掃描圈數(shù)的增多，電流緩慢下降至背景值，這表明了電極表面上逐漸覆蓋并形成了致密的非導(dǎo)電聚合膜，阻止了OAP 的進(jìn)一步氧化，使得伏安電流響應(yīng)受到抑制。而圖1B 為不加入CTC 的OAP 電聚合的CV 曲線，與圖1A 相比并無(wú)顯著差異，這表明CTC 的存在不干擾OAP 的電聚合。

3.2 分子印跡效應(yīng)

采用CV 及DPV 法表征了不同電極在0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.4)中的特性(圖2)。由DPV 表征曲線(圖2A)可知，裸電極(GCE)(曲線a)具有了較大的還原峰電流，說(shuō)明探針離子［Fe(CN)6］3-在GCE 表面發(fā)生了電化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生了峰電流。而非印跡膜電極(POAP/GCE)(曲線d)相較于GCE，幾乎沒(méi)有還原峰出現(xiàn)，這是由于覆蓋于電極上的不含CTC 的POAP/GCE 電極是非導(dǎo)電的，阻礙了探針［Fe(CN)6］3-的擴(kuò)散傳遞。印跡膜電極(MIP-POAP/GCE)(曲線b)相對(duì)于POAP/GCE 而言，還原峰電流有了明顯的大幅度提高，這是由于CTC-MIP-POAP/GCE 膜經(jīng)洗脫后所留有的印跡孔穴為［Fe(CN)6］3-提供了傳質(zhì)通道，在電極表面發(fā)生了電化學(xué)反應(yīng)。而洗脫再吸附CTC 的印跡膜電極(曲線c)相較于MIP-POAP/GCE 則出現(xiàn)峰電流值的下降，說(shuō)明2 × 10-7mol/L CTC 經(jīng)印跡膜所留有的孔穴，被吸附至MIP-POAP/GCE 電極上，一部分印跡孔穴被吸附上的CTC 阻塞，使得［Fe(CN)6］3-傳質(zhì)通道減少。CV 法與DPV 法的表征結(jié)果相符。

圖1 OAP 電化學(xué)聚合的循環(huán)伏安曲線:(A)加入CTC 的OAP 的NaClO4 底液;(B)OAP 的NaClO4底液(掃速:50 mV/s，掃描次數(shù):30)Fig.1 Cyclic voltammograms for the electrochemical polymerization of o-aminophenol (OAP)in the presence (A)and absence (B)of chlortetracyline (CTC)in sodium perchlorate aqueous solution (Scan rate:50 mV/s，cycling number:30)

圖2 不同電極在含0.005mol/L［Fe(CN)6］3-、0.1 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)中的差分脈沖伏安圖(A)和循環(huán)伏安圖(B)Fig.2 Differential pulse voltammograms (A)and cyclic voltammograms (B)of the electrodes in phosphate buffer solution of pH 6.4 containing 0.1 mol/L KCl and 0.005 mol/L K3［Fe (CN)6］

3.3 吸附時(shí)間對(duì)CTC分子印跡膜電化學(xué)響應(yīng)的影響

響應(yīng)時(shí)間是表征傳感器性能的一個(gè)重要參數(shù)，將MIP-POAP/GCE 膜電極浸入一定濃度金霉素溶液中進(jìn)行靜置吸附，每隔2 min 取出，并用二次蒸餾水淋洗干凈，在0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］PBS 中用DPV 法檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，峰電流逐漸下降，表明印跡位點(diǎn)逐漸被金霉素分子所占據(jù)，當(dāng)吸附時(shí)間超過(guò)20 min 后，峰電流基本達(dá)到平衡。因此選擇20 min 為最佳吸附時(shí)間。

3.4 CTC印跡膜的選擇性

選擇四環(huán)素、土霉素、氯霉素及青霉素作為干擾物并采用DPV 法考察MIP-POAP/GCE 膜電極對(duì)CTC 的選擇性。分別測(cè)定了修飾膜印跡電極對(duì)含5 ×10-6，7.5 ×10-6，1 ×10-5，1.5 ×10-5，2 ×10-5，4×10-5和8 ×10-5mol/L 的鹽酸金霉素及干擾物溶液的響應(yīng)，計(jì)算相對(duì)峰電流變化率(Δi/i0)，其中，Δi為MIP-POAP/GCE 膜電極對(duì)各種物質(zhì)響應(yīng)前后的峰電流差值，i0為印跡膜經(jīng)洗脫后的峰電流值。如圖3所示，氯霉素和青霉素對(duì)鹽酸金霉素幾乎無(wú)干擾，土霉素和四環(huán)素產(chǎn)生了極微弱的電流響應(yīng)。這是由于氯霉素及青霉素與CTC 的結(jié)構(gòu)差別較大，電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)變化極其微弱，而土霉素和四環(huán)素與CTC 的結(jié)構(gòu)相似，這使得有少量土霉素及四環(huán)素能夠被吸附到印跡分子修飾電極的孔穴上，從而引起微弱的電化學(xué)響應(yīng)，但對(duì)CTC 并沒(méi)有形成顯著干擾。這說(shuō)明印跡膜修飾電極與模板分子之間的作用不單是由與其互補(bǔ)的官能團(tuán)所決定，立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)所形成的印跡孔穴也有較大影響。

3.5 印跡膜電極的電化學(xué)響應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

印跡膜傳感器在含0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］的10 mL PBS(含0.1 mol/L KCl，pH 6.4)中逐次加入等分試樣20 μL 的1 ×10-5mol/L 的CTC，DPV 法進(jìn)行測(cè)定(圖4A)。將MIP-POAP/GCE 膜電極在空白溶液中所測(cè)得的峰電流與吸附不同濃度CTC 的CTCad-MIP-POAP/GCE 膜電極所測(cè)得的峰電流的差(ΔI)，與CTC 濃度的作圖，得到測(cè)定CTC 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4B)。CTC 在2.0 ×10-8～6.1 ×10-7mol/L 范圍內(nèi)與DPV 峰電流減少量呈線性關(guān)系，線性方程為y=11.19 +279.43x，R2=0.9989，CTC 的檢出限為1.5 ×10-8mol/L(3σ)。

不同方法檢測(cè)CTC 的結(jié)果見(jiàn)表1。與其它方法相比，本傳感器具有更低濃度的線性范圍，檢出限也更低，適用于快速檢測(cè)低濃度水平的鹽酸金霉素。

圖3 不同物質(zhì)在分子印跡膜電極上的相對(duì)峰電流變化率Fig.3 Δi/i0 ratio changes of MIP sensor vs.concentration of different substances

圖4 (A)不同鹽酸金霉素濃度下的差分脈沖伏安圖;(B)鹽酸金霉素濃度與峰電流差的關(guān)系Fig.4 (A)DPV curves of MIP-POAP/GCE after adsorption in different concentrations of CTC and(B)current peak difference vs CTC concentration on MIP-POAP/GCE

表1 本方法與其它方法檢測(cè)金霉素的結(jié)果比較Table 1 Comparison of detection results of CTC by this method and literature methods

3.6 印跡膜電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

使用過(guò)的印跡膜電極在洗脫溶液甲醇-0.5 mol/L H4SO4混合溶液(1∶4，V/V)中超聲清洗5 min，并用二次蒸餾水淋洗后即可使電極基本能恢復(fù)到使用前的響應(yīng)值。因此使用同一支印跡膜電極對(duì)2 ×10-7mol/L CTC 平行測(cè)定5 次，RSD 為1.9%，顯現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。將此印跡膜電極儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，2 周后在相同條件下下對(duì)2 ×10-7mol/L CTC 的測(cè)定值降至初始響應(yīng)的90.3%。經(jīng)4 周后，響應(yīng)值降至初始響應(yīng)的82.7%，具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

3.7 樣品分析

取市售的牛奶和雞肉樣品，經(jīng)本方法檢測(cè)均未檢出CTC。向牛奶及雞肌肉組織空白樣品溶液中加入0.1，0.2 和0.5 μmol/L 的CTC，每個(gè)濃度平行測(cè)定3 次，經(jīng)MIP-POAP/GCE 膜電極吸附后，置入含0.005 mol/L K3［Fe(CN)6］、0.1mol/L KCl 的PBS 中檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表2 所示。回收率為86.4% ～96.9%，RSD 為1.7% ～6.8%，可滿(mǎn)足實(shí)際樣品分析的需要。

表2 牛奶及雞肉組織樣品中CTC 的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery of CTC in milk and chicken muscle tissue samples

1 Fang H，Han Y L，Yin Y M，Pan X，Yu Y L.J.Chemosphere.，2014，96:51 －56

2 Alaboudi A，Basha E A，Musallam I.J.Food Control.，2013，33(1):281 －286

3 Patyra E，Kowalczyk E，Kwiatek K.J.B.Vet.I.Pulawy.，2012，56(3):329 －333

4 WANG Lei，XU Zhi-Xiu，ZHANG Xiao-Song，SHAO Xue-Guang.Chinese J.Anal.Chem.，2003，31(1):52 －54

王蕾，徐智秀，張孝松，邵學(xué)廣.分析化學(xué)，2003，31(1):52 －54

5 Le T，Yi S H，Zhao Z W，Wei W.Food.Addit.Contam.，2011，28(11):1516 －1523

6 WU Yu-Xiang，LIU Zhi-Guo，HAN Zeng-Fei，ZHANG Lu，SUN Tian.J.Food Sci.，2008，29(7):348 －351

武玉香，劉志國(guó)，韓增飛，張露，孫田.食品科學(xué)，2008，29(7):348 －351

7 ZHANG Lan，LIN Zi-An，XIE Zeng-Hong.Chinese J.Analysis and Testing Technology and Instruments，2004，10(1):18－23

張?zhí)m，林子俺，謝增鴻.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2004，10(1):18 －23

8 LIU Xing-Quan，F(xiàn)ENG Zhen，YAO Lei，LI Bo-Bin.Chinese J.Modern Food Science and Technology，2011，27(4):465 －467

劉興泉，馮震，姚蕾，李博斌.現(xiàn)代食品科技，2011，27(4):465 －467

9 Puoci F，Iemma F，Cirillo G，Curcio M，Parisi O I，Spizzirri U G，Picci N.J.Eur.Polym.，2009，45(6):1634 －1640

10 Amut E，F(xiàn)u Q，F(xiàn)ang Q，Liu R，Xiao A，Zeng A，Chang C.J.Polym.Res.，2010，17(3):401 －409

11 ZHANG Lian-Ming，LI Jian-Ping，PAN Hong-Cheng.Chinese J.Anal.Chem.，2012，40(7):1025 －1030

張連明，李建平，潘宏程.分析化學(xué)，2012，40(7):1025 －1030

12 Rosy，Chasta H，Goyal R N.Talanta，2014，125:167 －173

13 WANG Lin，TAN Xue-Cai，ZHAO Dan-Dan，LIU Li，LEI FU-Hou，HUANG Zai-Yin，GONG Qi.Chem.J.Chinese Universities，2012，33(8):1708 －1713

王琳，譚學(xué)才，趙丹丹，劉力，雷福厚，黃在銀，龔琦.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(8):1708 －1713

14 ZHANG Jin，XU Lan，WANG Ya-Qiong，LV Rui-Hong.Chinese J.Anal.Chem.，2009，37(7):1041 －1044

張進(jìn)，徐嵐，王亞瓊，呂瑞紅.分析化學(xué)，2009，37(7):1041 －1044

15 QI Yu-Bing，LIU Ying，SONG Qi-Jun.Chinese J.Anal.Chem.，2011，39(7):1053 －1057

齊玉冰，劉瑛，宋啟軍.分析化學(xué)，2011，39(7):1053 －1057

16 Tucceri R，Arnal P M，Scian A N.Canadian J.Chem.，2012，91(2):91 －112

17 Guerreiro J R L，F(xiàn)reitas V，Sales M G F.Microchem.J.，2011，97(2):173 －181