王甲甲，王智斌，黃文芳

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072)

細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4基因多態(tài)性與宮頸癌的相關(guān)性研究

王甲甲，王智斌，黃文芳

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072)

目的 探討細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因多態(tài)性與宮頸癌之間的相關(guān)性。方法 選取2012年12月至2014年7月292例宮頸癌患者(患者組)，及同期355例健康體檢者(對照組)，采集研究對象外周靜脈血5 ml，抽提全血基因組DNA，PCR擴(kuò)增后直接測序法檢測CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態(tài)性的分布。結(jié)果 Logistic回歸分析顯示，-318CC和CT60 AA基因型均與宮頸癌發(fā)病相關(guān)(P< 0.05)。與對照組比較，攜帶CTLA-4-318T、CT60 g等位基因的宮頸癌患者明顯增加(均P< 0.05)；攜帶CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宮頸癌患者，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 CTLA-4-318、CT60基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病有關(guān)。

CTLA-4；基因多態(tài)性；宮頸癌

宮頸癌是女性的第二大常見的惡性腫瘤[1]。人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是公認(rèn)的宮頸癌的高危因素，近90%的宮頸癌患者均可檢測到HPV感染，然而，并非所有感染HPV的病例均會發(fā)展為宮頸癌，這意味著環(huán)境因素、遺傳學(xué)或免疫學(xué)等因素可能在宮頸癌的發(fā)生過程中也起著關(guān)鍵的作用[2，3]。有學(xué)者認(rèn)為，宮頸癌患者體內(nèi)存在抑制性免疫微環(huán)境，特別是在年輕患者和病情嚴(yán)重患者更為明顯，其中T細(xì)胞表面的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)分子發(fā)揮重要作用[4]。人類CTLA-4基因定位于2號染色體長臂33帶(2q33)，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞上，它可與抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子結(jié)合并抑制T細(xì)胞的增殖與活化，其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與乳腺癌、黑色素瘤、腎癌等人類腫瘤的發(fā)生均有密切的關(guān)系[5～7]。為了驗證CTLA-4基因遺傳多態(tài)性是否與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)，我們選擇了CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A位點進(jìn)行對照研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2012年12月至2014年7月在四川省人民醫(yī)院就診且病理學(xué)確診為鱗癌的宮頸癌患者292例作為患者組，均為新發(fā)病例，年齡25～72歲，無任何治療經(jīng)歷。同期355例健康體檢人員作為對照組，無癌癥病史，無任何宮頸上皮病變，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性，宮頸分泌物HPV檢查陰性。通過填寫調(diào)查問卷的方式獲取各研究對象的臨床病理學(xué)信息，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，臨床資料及標(biāo)本采集均獲患者知情同意。除HPV 感染率外，兩組其他基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較 [n(%)]

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的獲取與保存 采集各研究對象空腹靜脈血5 ml于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝管中，用全血基因組小量抽提試劑盒提取全血DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Genbank中CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A的序列號(分別為rs5742909，rs3087243，rs231775)，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物的具體信息見表2，由上海生工公司合成。

1.2.3 HPV基因型的檢測 取各研究對象宮頸脫落細(xì)胞用導(dǎo)流雜交法(凱普公司人乳頭瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒)檢測感染的HPV基因型。

1.2.4 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態(tài)性的檢測 PCR體系組成如下(20 μl)：基因組DNA 2 μl(約0.2 μg)，10×PCR緩沖液2 μl，25 mM MgCl2溶液2 μl，10 mM dNTPs 2 μl，1 U/ μl Taq DNA聚合酶2 μl和5 μmol/L上、下游引物各1 μl，滅菌ddH2O 8 μl。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定PCR產(chǎn)物為目的片段，且無非特異性擴(kuò)增后，送上海生工公司進(jìn)行DNA測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件和SHEsis在線平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗；SHEsis在線平臺計算各位點間的連鎖不平衡并進(jìn)行組間單倍型頻率的比較；相關(guān)因素的探討采用Logistic回歸分析。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗 CTLA-4-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因型經(jīng)遺傳平衡檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P> 0.05)，具有群體代表性。

2.2 Logistic多元回歸分析 基因多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系 Logistic回歸分析顯示，-318CC和CT60 AA基因型均與宮頸癌發(fā)病有關(guān)(P< 0.05)。與對照組比較，攜帶CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宮頸癌患者明顯增加(χ2分別為13.482和14.138，均P<0.05)；攜帶CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宮頸癌患者，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表3。

表2 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A引物的基本信息

2.3 CTLA-4基因多態(tài)性單倍型與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系 不同CTLA-4-318 T/C和CT60 G/A單倍型攜帶者與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險關(guān)系的結(jié)果見表4，CTLA-4-318 C/CT60 A單倍型者發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險低于CTLA-4-318 T/CT60 G單倍型攜帶者(P<-0.05)，而CTLA-4-318 C/CT60 G，-318 T/CT60 A單倍型攜帶者發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險與CTLA-4-318 T/CT60 G單倍型者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。

表3 CTLA-4 SNPs 在兩組的分布情況

表4 CTLA-4基因多態(tài)性單倍型與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

3 討論

CTLA-4是細(xì)胞表面共刺激分子，與CD28分子屬于同一家族，均可與B7細(xì)胞表面分子相結(jié)合，在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的遺傳易感性上起重要作用[8]。CD28/B7復(fù)合物與CT LA-4/B7復(fù)合物在T細(xì)胞反應(yīng)機(jī)制上的作用截然相反，前者能夠促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，而后者對免疫反應(yīng)起下調(diào)和抑制作用[9]。Janeway等[10]提出T細(xì)胞激活的雙信號理論，第一信號由T細(xì)胞受體TCR與MHC抗原肽的結(jié)合提供，第二信號由APC表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而提供。CTLA-4作為CD28的拮抗劑，競爭性與APC表面的相應(yīng)配體B7結(jié)合，從而下調(diào)T細(xì)胞的反應(yīng)，是傳遞第二信號的重要分子。大量文獻(xiàn)報道，CTLA-4基因多態(tài)性與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，近年來，CTLA-4基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系得到了越來越多的關(guān)注，本研究即旨在探討CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性。

挑選292例宮頸癌患者和355例年齡匹配的健康對照者參與本研究。由于HPV感染與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切，所有參與對象均需進(jìn)行常規(guī)的HPV DNA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，87.0%的宮頸癌患者HPV檢測均為陽性，這與其他研究報道結(jié)果基本一致[11]。采集各參與者的外周血，分別對292例宮頸癌患者和355例健康對照者進(jìn)行CTLA-4 SNPs(-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A)的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，-318CC和CT60 AA基因型均與降低宮頸癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，與對照組比較，攜帶CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宮頸癌患者明顯增加。相反，CTLA-4 +49 G/A基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生無相關(guān)關(guān)系(P> 0.05)。有報道卻認(rèn)為，CTLA-4 +49基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生有密切關(guān)系，這可能與種族差異、樣本量大小等有關(guān)[12]。

單倍型是指一條染色體上緊密連鎖的多個等位基因的線性排列。SNP單倍型就是不同SNPs位點上核苷酸堿基的線性排列，每一種線性排列稱為一種SNP單倍型。理論上講單倍型出現(xiàn)的頻率應(yīng)是各個基因頻率的乘積，但事實卻非如此，連鎖的單倍型并不是隨機(jī)組合的，而是某些基因更多或更少的連鎖在一起，即所謂的“連鎖不平衡”。在探討基因與疾病的相關(guān)性時，單倍型分析可能提供更多的信息，有利于更精確和客觀地分析疾病的遺傳易感性。由于前述研究結(jié)果認(rèn)為，CTLA-4 +49 G/A基因多態(tài)性與宮頸癌的發(fā)生無明顯的相關(guān)性，該研究僅對CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多態(tài)性位點是否存在連鎖不平衡進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTLA-4-318 C/CT60 A與降低宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，提示這兩個多態(tài)性位點可能存在連鎖不平衡。

綜上所述，本研究認(rèn)為CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多態(tài)性與宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。然而我們的結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和種族進(jìn)行驗證。對于CTLA-4基因多態(tài)性的研究將有助于預(yù)測宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險，提高宮頸癌的預(yù)防及早期診斷水平。

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The correlation of cytotoxic T lymphocyte antigen 4 polymorphisms with occurrence of cervical cancer

WANG Jia-jia，WANG Zhi-bin，HUANG Wen-fang

(Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To explore the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen 4(CTLA-4)genotypes-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A and occurrence of cervical cancer.Methods Two hundred and ninety-two patients with cervical cancer from December 2012 to July 2014 were selected as study group，and 355 cases of healthy controls were recruited as control group.Peripheral blood of each participant was collected and genomic DNA was extracted.The distribution of CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A genotypes were detected by direct sequencing.Results The CTLA-4-318 CC and CT60 AA genotypes were correlated with the decrease of cervical cancer risk(P< 0.05).Compared with control group，the frequencies of CTLA-4-318T allele and CT60 g allele carriers were significantly higher in the cancer patients(P< 0.05).No significant differences were found in the genotype and allele frequencies in +49 G/A between patients and healthy controls(P> 0.05).Conclusion The polymorphisms of CTLA-4-318 and CT60 are correlated with cervical cancer risk.

CTLA-4；Genetic polymorphisms；Cervical cancer

R446.62

A

1672-6170(2015)05-0077-04

2015-02-26；

2015-04-30)