佘曉玲，王 濤，丁文靜，吳文娟，潘耀振，湯可立，王丹霓，王 和＊

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴州貴陽 550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科，貴州貴陽 550004；3.貴州省人民醫(yī)院外科，貴州貴陽 550002；4.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025）

沙門菌（Salmonella）是腸桿菌科細(xì)菌中的常見病原菌，其不僅能夠感染豬、禽等多種動物和引起動物的疾病，而且也可通過畜禽肉制品及排泄物經(jīng)消化道感染人體和引起人類的多種疾病［1-2］。有文獻(xiàn)報道［3］，沙門菌感染動物后可進入宿主膽囊并且在膽囊內(nèi)長期攜帶，使動物成為沙門菌的重要儲存宿主與傳染源。然而用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法，在正常動物的膽囊標(biāo)本內(nèi)卻很少分離到沙門菌［4］。細(xì)菌L型是細(xì)菌的細(xì)胞壁缺陷變異型，細(xì)菌在膽汁、抗生素等因素的作用下可發(fā)生細(xì)胞壁缺陷變異。細(xì)菌形成L型后不但形態(tài)和培養(yǎng)特性發(fā)生改變，而且其代謝活性、抗原性、致病性、藥物敏感性等多種特性均可發(fā)生改變，成為常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法不能檢出的潛在病原體［5］。為了解豬膽囊中沙門菌的攜帶情況，本文采用非高滲分離培養(yǎng)法對貴陽市區(qū)采集的健康生豬膽囊標(biāo)本進行了沙門菌及其L型的分離和基因檢測，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集與處理 2011年-2012年期間，在貴陽市區(qū)3所屠宰場采集970份健康生豬的膽囊組織和膽汁標(biāo)本。按文獻(xiàn)［6］方法剪碎膽囊組織塊。

1.1.2 主要試劑與儀器 10×buffer、dNTPs、MgCl2、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖，ICN公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，Tiangen公司產(chǎn)品；PCR儀，SensoQuest公司產(chǎn)品；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；PG 液（protein-glucose broth）、SS瓊脂平板、沙保弱瓊脂平板，均按文獻(xiàn)［5］方法配制。

1.1.3 沙門菌L型基因檢測引物 沙門菌屬invA基因的特異性引物 （F：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′）序列參照文獻(xiàn)［7］由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴增產(chǎn)物的長度為284bp。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌分離培養(yǎng) 按文獻(xiàn)［6］方法分別取膽汁和膽囊組織塊涂布法接種SS瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)18h～24h，按文獻(xiàn)［8］以常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法鑒定可疑菌。

1.2.2 細(xì)菌L型非高滲分離培養(yǎng) 按文獻(xiàn)［6］方法取膽汁和膽囊組織塊分別接種于4mL PG液，37℃溫箱培養(yǎng)3d～5d，取1mL培養(yǎng)物經(jīng)0.22μm孔徑濾菌器過濾后接種PG液培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌L型生長情況。細(xì)菌L型生長后，傳代培養(yǎng)3次以上獲得穩(wěn)定L型純培養(yǎng)物。

1.2.3 細(xì)菌L型生物學(xué)鑒定 按文獻(xiàn)［5］方法鑒定L型，包括形態(tài)與培養(yǎng)特性、革蘭染色與細(xì)胞壁染色性、濾過性。

1.2.4 沙門菌L型的基因檢測 按試劑盒方法提取L型傳代培養(yǎng)物的DNA模板，同樣方法提取傷寒沙門菌（Salmonellatyphi）H901、甲型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiA）、乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）及大腸埃希菌（Escherichiacoli）ATCC25922的染色體 DNA，分別進行invA的PCR擴增和15g／L瓊脂糖凝膠電泳，陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向序列測定和分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌及其L型

970例膽囊標(biāo)本的常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法分離培養(yǎng)均未檢出沙門菌細(xì)菌型，非高滲分離培養(yǎng)可檢出細(xì)菌L型80例，檢出率為8.25%。

2.2 穩(wěn)定細(xì)菌L型的生物學(xué)鑒定

膽囊L型菌培養(yǎng)3d～5d后，液體培養(yǎng)基仍澄清，在光學(xué)顯微鏡下可見圓球、卵圓形或不規(guī)則形態(tài)，半透明，單個、成雙、短鏈或成堆排列，可通過0.22μm孔徑濾菌器，接種常規(guī)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基及沙保諾瓊脂培養(yǎng)基未見細(xì)菌生長，革蘭染色及細(xì)胞壁染色均陰性（圖1）。

2.3 沙門菌L型基因檢測

沙門菌質(zhì)控株及50例豬膽囊分離細(xì)菌L型DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果可見陽性目標(biāo)條帶，大腸埃希菌未見陽性目標(biāo)條帶（圖2）。L型擴增產(chǎn)物序列分析結(jié)果與 GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中核苷酸數(shù)據(jù)庫基因序列比對，L型菌株的核苷酸序列與GenBank中注冊的沙門菌invA基因序列的同源性最高，為100%（圖3）。invA基因鑒定法檢出沙門菌L型的陽性率為5.15%，占膽囊分離細(xì)菌L型的62.50%。

圖1 豬膽囊分離的細(xì)菌穩(wěn)定L型細(xì)胞純培養(yǎng)物（400×）Fig.1 The pure cultures of bacterial stable L-form isolated from pig gallbladder（400×）

圖2 豬膽囊分離的細(xì)菌L型沙門菌invA基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of PCR products of Salmonella invA gene of L-forms isolated from pig gallbladder

圖3 豬膽囊分離的沙門菌L型與沙門菌的invA基因序列同源性比較Fig.3 The homology comparison for invA gene between the L-forms isolated from pig gallbladder and Salmonellain GenBank

3 討論

沙門菌是引起人獸共患病的重要病原菌之一，其廣泛分布于自然界并且可寄生于人或動物腸道與膽囊內(nèi)，主要通過污染的食物、飲水經(jīng)糞-口途徑傳播［1-2］。沙門菌感染動物不但可成為引起沙門菌病重要的傳染源，而且也可對食品安全、動物檢疫、動物試驗結(jié)果產(chǎn)生重要的影響。因此，沙門菌感染的防控備受各國公共衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和食品安全等部門的普遍關(guān)注。目前國內(nèi)外對動物沙門菌感染的檢查方法主要為常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)及特異性抗原與抗體檢測，通過細(xì)菌生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗進行菌種鑒定［9］。然而由于沙門菌分離培養(yǎng)較為困難及其抗原性變異等因素，造成動物沙門菌感染的檢出率較低［10］。研究結(jié)果顯示，在貴陽市區(qū)采集的970份健康生豬膽囊標(biāo)本內(nèi)，采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法在其絕大多數(shù)標(biāo)本內(nèi)均不能檢出細(xì)菌以及沙門菌的細(xì)菌型，但采用細(xì)菌L型的非高滲分離培養(yǎng)法卻可在這些常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法檢查“無菌”和沙門菌分離培養(yǎng)陰性的豬膽囊標(biāo)本內(nèi)檢出較高陽性率的細(xì)菌L型。通過沙門菌特異性基因invA檢測，證實這些生豬膽囊可攜帶沙門菌L型。提示許多細(xì)菌和沙門菌感染豬的膽囊后，可發(fā)生細(xì)胞壁缺陷變異和成為穩(wěn)定L型，造成這些生豬成為常規(guī)細(xì)菌型方法分離培養(yǎng)陰性的健康帶菌動物，但卻成為膽囊攜帶沙門菌L型以及其他某些細(xì)菌L型的健康帶菌動物。

細(xì)菌L型是細(xì)菌的細(xì)胞壁缺陷變異型，已知許多抗生素、抗體、補體、膽汁等因素均可誘導(dǎo)各種細(xì)菌形成L型［5］。文獻(xiàn)報道［11］，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等細(xì)菌在體外可被膽汁誘導(dǎo)成L型。王和［5］報道，細(xì)菌形成L型后不但形態(tài)和培養(yǎng)特性發(fā)生改變，而且其代謝活性、抗原性、致病性、藥物敏感性等多種特性均可發(fā)生改變。文獻(xiàn)報道［12］，用傷寒沙門菌感染實驗動物，可在常規(guī)細(xì)菌型方法分離培養(yǎng)無菌的動物膽囊內(nèi)檢出傷寒沙門菌穩(wěn)定L型。因此認(rèn)為細(xì)菌L型不但可引起宿主組織的慢性損害，而且其保留了重新合成細(xì)胞壁和返祖成為細(xì)菌型的性質(zhì)，以致其成為重要的潛在病原體和引起疾病發(fā)生與流行的主要傳染源［5-6，12］。研究結(jié)果顯示，沙門菌感染豬膽囊后也可成為穩(wěn)定L型，成為常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)法不能檢出的潛在病原體。本文用非高滲分離培養(yǎng)方法從健康生豬的膽囊標(biāo)本內(nèi)分離培養(yǎng)細(xì)菌穩(wěn)定L型的陽性率達(dá)到8.25%，其中沙門菌穩(wěn)定L型檢出率達(dá)到5.15% ，占膽囊分離細(xì)菌L型的62.50%。提示市售健康生豬的膽囊可存在多種細(xì)菌L型感染，其中沙門菌穩(wěn)定L型具有較高的感染率。這些細(xì)菌L型不但可引起豬膽囊的慢性損害，而且其中的沙門菌或其他某些病原菌的L型一旦重新合成細(xì)胞壁返祖，則可成為引起傳染病發(fā)生或流行的重要傳染源。

細(xì)菌穩(wěn)定L型由于喪失了其親代細(xì)菌型具有的形態(tài)、代謝、表面抗原等特性，因此不能用常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法鑒定［5-6，12］。但細(xì)菌穩(wěn)定L型可保留其親代細(xì)菌型的特異性核苷酸堿基序列，從而有助于穩(wěn)定L型的基因檢測與鑒定［5］。文獻(xiàn)報道［13-16］，沙門菌invA基因序列編碼與菌細(xì)胞吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白，它是一段只存在于致病性沙門菌屬特異性的保守基因序列。用此基因的引物檢測和鑒定沙門菌，其陽性率可達(dá)94.2%以上，因此國內(nèi)外通常選用invA基因檢測對沙門菌感染及其菌種進行診斷與鑒定［15、17-19］。研究結(jié)果顯示，常規(guī)細(xì)菌型方法不能鑒定的沙門菌穩(wěn)定L型仍然保留了與其親代沙門菌細(xì)菌型一致的invA基因及其核苷酸序列，表明invA基因PCR擴增及其核苷酸測序分析方法，有助于了解豬膽囊中沙門菌L型的攜帶情況。

［1］李丹丹，徐義剛，王綏家，等.動物性食品中沙門菌實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2014，35（5）：24-30.

［2］劉 杰，張秀麗，陳 磊，等.肉豬養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)沙門菌污染狀況監(jiān)測分析［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2013，25（1）：61-64.

［3］張 琦，付明哲，陳曉霖.豬鼠傷寒沙門氏菌的分離與鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011，27（4）：34-35.

［4］李 毅.食品中沙門菌檢測方法進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（2）：251-253.

［5］王 和.男科感染病學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2011：173-199.

［6］王 和，余秀專，徐 英.用非高滲透壓培養(yǎng)基從慢性膽囊炎膽囊分離細(xì)菌L型［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1994，17（5）：263-265.

［7］Soria M C，Soria M A，Bueno D J.Comparison of 2culture methods and PCR assays forSalmonelladetection in poultry feces［J］.Poult Sci，2012，91（3）：616-626.

［8］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜，等.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.江蘇南京：東南大學(xué)出版社，2010：825-827.

［9］郭 潤，霞魯波，張 偉，等.沙門菌檢測技術(shù)現(xiàn)況［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（10）：1917-1920.

［10］陳 玲，張菊梅，楊小鵑，等.南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型［J］.微生物學(xué)報，2013，53（12）：1326-1333.

［11］傅曉琰.從25例膽囊疾病患者膽汁中分離出5株細(xì)菌L型的報道［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，31（9）：1430-1431.

［12］王 和，陳崢宏，余秀專.慢性膽囊炎與膽囊結(jié)石的細(xì)菌L型病因?qū)W研究［J］.醫(yī)學(xué)研究通訊，2004，33（4）：32-33.

［13］張 冰，張煥容，湯 承，等.藏系綿羊源沙門菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的分離與PCR鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（4）：13-18.

［14］陳金頂，索青利，廖 明，等.沙門氏菌的invA基因序列分析與分子檢測［J］.中國人獸共患病雜志，2004，20（10）：868-871.

［15］李業(yè)鵬，鐘 凱，楊寶蘭，等.食品中沙門菌PCR檢測方法的建立［J］.中國食品衛(wèi)生雜志.2006，18（1）：17-22.

［16］Zhao S，Qaiyumi S，F(xiàn)riedman S，et al.Characterization ofSalmonellaentericaserotype newport isolated from humans and food animals［J］.J Clin Microbiol，2003，41（12）：5366-53711.

［17］Galan J E，Curtiss R.Distribution of the invA ，-B，-C，and-D genes ofSalmonellatyphimuriumamong otherSalmonellaserovars：invA mutants ofSalmonellatyphiare deficient for entry into mammalian cells［J］.Infect Immun，1991，59（9）：2901-2908.

［18］Nolan L K，Giddings C W，Brown J.The distribution of invA，pagC and spvC gene amongSalmonellaisolates from animals［J］.Vet Res Commun，1995，19（3）：167-177.

［19］Bulte M，Jakob P.The use of a PCR-generated invA probe for the detection ofSalmonellaspp.in artificially and naturally contaminated foods［J］.Int J Food Microbiol，1995，26（3）：335-344.