宋旭日，胡 靜，張松波，郭中奎，滕淑靜＊

（1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南岳陽 414000；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河 462000）

大蒜新素（allicin）是大蒜的主要有效成分，化學(xué)名為二烯丙基三硫，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用［1］。研究報(bào)道，大蒜新素對膀胱癌［2］、直腸癌［3］的轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，大蒜新素對宮頸癌Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力也有抑制作用［4］，但具體機(jī)制還有待闡明。Rho蛋白家族是小G蛋白R(shí)as超家族成員，在細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重組調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Rho蛋白在多種惡性腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)［5］，提示其所介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可能與瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。Rac1（Ras-related C3botulinum toxin substrate 1）和 Cdc42（cell division cycle 42）是研究最多的兩個(gè)Rho蛋白。Rac1可誘導(dǎo)層狀偽足的形成，Cdc42可誘導(dǎo)絲狀偽足的形成。細(xì)胞偽足的形成是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的起始步驟。另外，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中涉及到基底膜的突破和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜［6］，說明其在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)擬探討大蒜新素是否通過影響Rho蛋白和MMPs的表達(dá)抑制Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞，由中南大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.1.2 主要試劑 大蒜新素為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，純度＞99.5%；RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品；鼠抗人Rac1單抗、鼠抗人Cdc42單抗、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔二抗為Santa Cruz產(chǎn)品；Western印跡熒光檢測試劑盒為南京賽博生物科技有限公司產(chǎn)品；Trizol及RT-PCR試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含100mL／L新生小牛血清、1×105U／mL青霉素和10mg／mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)組加大蒜新素使其終濃度為100μmol／L，對照組加等量PBS，置于37℃孵育24h。

1.2.2 Western blot檢測Rac1和Cdc42的表達(dá)收集試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞各5×106個(gè)，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液并置冰上裂解30min，離心吸取上清液，加5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5min；電泳后轉(zhuǎn)膜；50g／L脫脂牛奶室溫封閉2h，加抗人Rac1、Cdc42或 GAPDH 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST洗3次，加相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），37 ℃孵育約1h；TBST 洗膜后用 Western印跡熒光檢測試劑盒于X光片上顯示結(jié)果。

1.2.3 半定量RT-PCR法檢測Hela細(xì)胞 MMP2 mRNA的表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)接種貼壁生長后，試驗(yàn)組加大蒜新素使其終濃度為100μmol／L，對照組加等量PBS，24h后收集細(xì)胞并提取細(xì)胞的總RNA，各取2μg按RT-PCR試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增MMP-2基因片段，擴(kuò)增 MMP-2所用引物序列為5′-TGACGGTAAGGACGGACTC-3′， 5′-TGCCCTGGAAGCGGAATGG-3′，產(chǎn)物347bp，擴(kuò)增條件：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；延伸10min，終止反應(yīng)。10g／L瓊脂糖電泳分析，以GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 大蒜新素對Hela細(xì)胞Rac1和Cdc42蛋白表達(dá)的影響

大蒜新素試驗(yàn)組表達(dá)Rac1和Cdc42比加PBS對照組有所減少。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行灰度掃描后統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），結(jié)果見圖1。

圖1 大蒜新素對Hela細(xì)胞Rac1和Cdc42蛋白表達(dá)的影響（＊＊P＜0.05，n＝3）Fig.1 Effect of allicin on Rac1and Cdc42expression by Hela cells（＊＊ P＜0.05，n＝3）

2.2 大蒜新素對Hela細(xì)胞MMP2mRNA表達(dá)的影響

試驗(yàn)組Hela細(xì)胞MMP2mRNA的表達(dá)明顯減少，其條帶灰度比值為0.204 6±0.085，與對照組的表達(dá)（條帶灰度比值為0.893 6±0.271）比較，統(tǒng)計(jì)分析具有顯著差異（P＜0.01）。如圖2所示。

圖2 大蒜新素對Hela細(xì)胞 MMP2mRNA表達(dá)的影響（＊＊P＜0.01，n＝3）Fig.2 Effect of allicin on MMP2mRNA expression by Hela cells（＊＊ P＜0.01，n＝3）

3 討論

Rho蛋白家族是小G蛋白R(shí)as超家族成員，相對分子質(zhì)量介于20ku～25ku，具有GTP酶活性，被稱為Rho GTP酶。該家族成員根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同大致分為Rho亞家族（RhoA、RhoB、RhoC），Rac亞家族 （Rac1、Rac2、Rac3），Cdc42 亞 家 族（Cdc42、TC10、TCL、Wrch1、chp／Wrch2），Rnd亞家族（Rnd1、Rnd3／RhoE、Rnd2），Rho BTB 亞家族（Rho BTB1和 Rho BTB2）等 5 個(gè)亞家族。Rho GTP酶在調(diào)控細(xì)胞骨架重組、改變細(xì)胞形態(tài)、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力方面起著非常重要的作用。研究顯示，Rac和Cdc42通過與 WiskottAldrich綜合征蛋白相互作用激活A(yù)rp2／3復(fù)合物促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，誘導(dǎo)偽足的形成［7-8］；而Rho通過激活Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK），增加肌動(dòng)-肌球蛋白的收縮力、使細(xì)胞體尾部收縮、促使細(xì)胞在ECM中的遷移；并且Rho還可通過活化mDia蛋白促進(jìn)張力纖維形成、增加黏著斑上肌動(dòng)蛋白依賴性的c-Src募集，誘導(dǎo)黏著斑解離［9］。惡性腫瘤具有向鄰近組織浸潤和向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。研究顯示，胃癌、乳腺癌、肝癌、直結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)Rho蛋白［5］。由此推測，Rho蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、向鄰近組織浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Montalvo-Ortiz B L等［10］用 Rac的抑制劑EHop-016處理高表達(dá)Rac的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435，瘤細(xì)胞Rac1的表達(dá)及活性明顯受到抑制且轉(zhuǎn)移能力減弱；Zins K等［11］用合成的化合物AZA197處理人直腸癌細(xì)胞，Cdc42表達(dá)減少，瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制。本研究結(jié)果顯示，大蒜新素處理的Hela細(xì)胞表達(dá)Rac1和Cdc42也明顯減少，提示大蒜新素抑制Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與下調(diào)Rho蛋白的表達(dá)有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞在遷移運(yùn)動(dòng)的過程中，要突破細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜才能向鄰近組織浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。MMPs是一類鋅依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，幾乎能降解ECM的各種成分，是降解ECM的主要酶類。研究表明，異常高表達(dá)MMPs可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［12］。Song N R等［13］研究發(fā)現(xiàn)白皮杉醇可通過抑制人乳腺癌細(xì)胞MMP-2的表達(dá)減弱其轉(zhuǎn)移能力；Moroz A等［14］研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)人前列腺癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的侵襲能力；王云彬等［2］在用大蒜新素處理人膀胱癌T24細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)T24細(xì)胞表達(dá)MMP-9明顯減少且侵襲能力減弱。本研究顯示，大蒜新素處理的Hela細(xì)胞MMP-2表達(dá)明顯減少，提示大蒜新素抑制Hela細(xì)胞的侵襲能力與下調(diào)MMPs表達(dá)有關(guān)。

Rho蛋白必須與鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）結(jié)合并活化、具有GTP酶活性后才能激活下游分子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。Montalvo-Ortiz B L等［10］發(fā)現(xiàn) EHop-016通過干擾 Rac1與其GEF Vav2的結(jié)合影響Rac1的活化而發(fā)揮作用；EHop-016還可抑制Rac1的下游分子PAK1的活性。Zins K等［11］也發(fā)現(xiàn)隨著 Rac1／Cdc42活性的下降，其下游分子PAK和AKT的活性也減弱。MMPs受多條信號通路調(diào)控。Lu K W 等［15］研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移能力下降的癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2、MMP-9減少與ERK1／2信號通路有關(guān)。本研究的結(jié)果顯示大蒜新素抑制Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與下調(diào)Rac1／Cdc42、MMP-2的表達(dá)有關(guān)，但具體的機(jī)制尚不清楚；而且，Rac1／Cdc42與 MMP-2之間有無關(guān)聯(lián)，都有待進(jìn)一步探討。

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