趙 靜，王 利

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）是鲇形目，鲿科，黃顙魚屬中一種重要的經(jīng)濟(jì)淡水魚，俗稱黃辣丁或嘎牙子。黃顙魚環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)，且肉質(zhì)鮮嫩，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)多個(gè)地區(qū)已有廣泛養(yǎng)殖。近年來，眾多學(xué)者已對(duì)黃顙魚生物學(xué)特性、人工養(yǎng)殖技術(shù)及感染嗜水氣單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等相關(guān)研究做了一些報(bào)道［1-4］。然而，尚缺乏有關(guān)黃顙魚感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后其脾臟和腎臟組織病理學(xué)變化的報(bào)道。

脾臟和腎臟作為魚類重要的免疫器官和造血器官，在魚類的非特異性免疫中發(fā)揮著不可替代的作用。目前，已有黃顙魚、鯉魚和紅笛鯛等魚類脾臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道，豐富了研究魚體免疫系統(tǒng)的資料，但還沒有黃顙魚感染病原菌后脾臟和腎臟病理學(xué)變化的報(bào)道［5-7］。因此，本試驗(yàn)對(duì)黃顙魚感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后脾臟和腎臟的組織和超微結(jié)構(gòu)的病理變化進(jìn)行研究，以期為該菌感染黃顙魚的致病機(jī)理及臨床診斷等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康黃顙魚采于成都周邊某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重平均40g±5g，體長(zhǎng)18cm±5cm。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株GM2402，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 人工感染試驗(yàn) 挑選20條健康黃顙魚隨機(jī)分為2組：對(duì)照組和試驗(yàn)組。按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲脻舛葹?.0×108cfu／mL的菌懸液用以人工感染。每條黃顙魚注射0.15mL菌液，對(duì)照組注射等量7.5g／L生理鹽水。試驗(yàn)期間水溫控制在20℃～25℃之間，正常充氧，觀察記錄魚體發(fā)病情況。試驗(yàn)2周后，取典型發(fā)病癥狀和對(duì)照組魚體的脾臟和腎臟用于顯微和超微切片的制備。

1.2.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察 參照金銀姬和王思蘆等［8-9］病理切片制作方法，具體過程如下：取患病魚體的腎臟和脾臟組織，用100mL／L的甲醛固定，流水沖洗過夜，然后用不同濃度梯度酒精脫水、二甲苯進(jìn)行透明、最后石蠟包埋。用Leica（RM2235）輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切成厚度為5μm的薄片，HE染色，在Leica（DM2500）光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 將組織用25mL／L戊二醛進(jìn)行固定后，磷酸緩沖液沖洗，用10mL／L餓酸再次固定，磷酸緩沖液沖洗，并依次用不同濃度的乙醇脫水，進(jìn)行包埋、定位、超薄切片、醋酸鈾及檸檬酸鉛復(fù)染，置于透射電鏡儀（Tecnia G F20型）下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及解剖變化

在兩周試驗(yàn)期中，正常組未見異常變化，試驗(yàn)組在腹腔注射24h后，魚體開始對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，發(fā)病率約為80%，死亡率約為50%，且表現(xiàn)為嘴邊緣出血，胸鰭、背鰭基部嚴(yán)重出血，腹部腫大，肛門紅腫外突，最后死亡。剖檢可見腹水，脾臟腫大，呈紫黑色；腎臟腫大（圖1）。

圖1 黃顙魚體病理解剖變化Fig.1 Pathological lesions of Pelteobagrus fulvidraco

2.2 組織病理學(xué)變化

顯微鏡下觀察脾臟和腎臟出現(xiàn)不同程度的病理變化。

脾臟：脾臟紅髓和白髓界限模糊，組織結(jié)構(gòu)疏松，脾竇擴(kuò)張充滿紅細(xì)胞（圖2A）。淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，大量紅細(xì)胞充滿整個(gè)脾臟組織（圖2B）。

腎臟：腎臟組織結(jié)構(gòu)疏松，腎小球出現(xiàn)萎縮，囊腔間隙增大（圖2C），在腎小管和腎小球周邊間質(zhì)內(nèi)局部有大量紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。腎小管出現(xiàn)不同程度的病變，上皮細(xì)胞水腫，管腔消失并伴有胞質(zhì)溶解出現(xiàn)空泡化（圖2D）。

圖2 感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的黃顙魚脾臟和腎臟病理變化Fig.2 Histopathological lesions of spleen and kidney of Pelteobagrus fulvidracoinfected with Yersina enterocolitica

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

通過透射電子顯微鏡可觀察到，脾臟組織的網(wǎng)狀上皮細(xì)胞腫脹，膜邊緣破損，胞核變小，巨噬細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)邊移（圖3A）。脾淋巴細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)密度增高，胞核裂解成大小不等小體（圖3B）。溶酶體數(shù)量增加，線粒體腫脹呈圓形，嵴排列紊亂。腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)廣泛性融合，胞核固縮結(jié)構(gòu)模糊。腎間質(zhì)的淋巴細(xì)胞胞核固縮，染色質(zhì)邊移，嚴(yán)重時(shí)核膜破裂（圖3C）。溶酶體顆粒增多，線粒體腫脹呈圓形或橢圓形，嵴斷裂、溶解囊泡化（圖3D）?；状置鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)排列散亂，核糖體顆粒脫落。

圖3 感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的黃顙魚超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Ultrastructural changes of Pelteobagrus fulvidraco infected with Yersina enterocolitica

3 討論

腎臟和脾臟作為魚類重要的免疫器官和造血器官，尤其是魚類特異性免疫還未完善，在魚類免疫系統(tǒng)中顯得極其重要。脾臟作為魚體體液免疫和細(xì)胞免疫的中心，含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可以吞噬外來病原體和衰老紅細(xì)胞，提高機(jī)體抵抗力。淋巴細(xì)胞中的B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下可增殖分化出漿細(xì)胞，參與抗腫瘤或其他免疫機(jī)制。已有研究表明瓦氏黃顙魚、草魚等硬骨魚類的脾臟結(jié)構(gòu)十分相似，脾臟動(dòng)脈中充滿紅細(xì)胞，組織中存在大量淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞［10-12］。祁保霞等［5］研究報(bào)道黃顙魚的脾臟結(jié)構(gòu)清晰，含有大量淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示脾竇充血，組織間隙充滿大量紅細(xì)胞，表明病魚脾臟組織結(jié)構(gòu)受到破壞，致使造血機(jī)能受損，影響血液循環(huán)和代謝機(jī)能，免疫力下降。劉小玲等［13］研究報(bào)道黃顙魚的腎臟中分布著大量淋巴細(xì)胞，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。黃顙魚感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后腎小球萎縮，導(dǎo)致過濾功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，但這與黃顙魚出現(xiàn)腹水癥和紅頭病后病變明顯不同，可能是由于病原菌不同所致［14-16］。腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、變性，這與黃河鯉出現(xiàn)爛鰓病時(shí)，腎臟的病變相似［17］。腎小管上皮細(xì)胞水腫變性影響了重吸收和分泌功能，這在一定程度上加速魚的發(fā)病死亡。

超微結(jié)構(gòu)觀察腎臟和脾臟組織細(xì)胞中線粒體損傷最嚴(yán)重，表現(xiàn)為腫脹，嵴斷裂、消失。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的能量代謝場(chǎng)所，同時(shí)也是細(xì)胞呼吸代謝中心。線粒體結(jié)構(gòu)的破壞必然影響細(xì)胞內(nèi)各種生化活動(dòng)的正常進(jìn)行，能量來源的中斷致使細(xì)胞內(nèi)外鈉鉀泵平衡失調(diào)，造成細(xì)胞內(nèi)鈉離子潴留，導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出腫脹。這與羅非魚、高體鰤在感染海豚鏈球菌、類結(jié)節(jié)病后線粒體受損一致［18-19］。線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，致使機(jī)體能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生廣泛性損傷，但線粒體的變化是否會(huì)對(duì)魚體發(fā)病機(jī)理的深入研究具有重要指導(dǎo)意義，還有待深入研究。在脾臟和腎臟細(xì)胞中溶酶體數(shù)量增多，可能是機(jī)體在抗損傷的過程中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞吞噬凋亡淋巴細(xì)胞使得溶酶體數(shù)量增多。

綜上所述，在高密度養(yǎng)殖的情況下，黃顙魚機(jī)體抗病力會(huì)受到一定的影響，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可趁機(jī)侵襲魚體，然后通過腸道黏膜入侵淋巴組織，并通過血液循環(huán)進(jìn)入組織器官。而脾臟和腎臟作為黃顙魚重要的造血器官和免疫器官，在魚體抵抗病原菌的過程中組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的損傷。因此，進(jìn)一步探討小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對(duì)黃顙魚其他組織的病理變化，這對(duì)深入研究該菌感染黃顙魚的致病機(jī)理和疾病的準(zhǔn)確診斷具有重要意義。

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