李慧+李?lèi)?ài)+彭立新+閻國(guó)榮

摘要：器官大小是植物形態(tài)的重要表現(xiàn)特征之一，也是決定一些作物或經(jīng)濟(jì)植物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。研究證實(shí)，草本植物如擬南芥中EBP1類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可從細(xì)胞數(shù)量和體積2個(gè)方面同時(shí)調(diào)控植物器官大小，但該基因在木本植物楊樹(shù)中的結(jié)構(gòu)及功能仍未知。本研究依托楊樹(shù)全基因組及EST數(shù)據(jù)信息，采用生物信息學(xué)方法結(jié)合基因同源序列克隆，首次對(duì)楊樹(shù)中的EBP1全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆及序列分析，同時(shí)成功構(gòu)建了用于遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：楊樹(shù);EBP1基因;克隆;表達(dá)載體;構(gòu)建;基因序列分析;蛋白同源性比對(duì)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0014-03

收稿日期：2014-05-25

基金項(xiàng)目：天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金（編號(hào)：20120619）;天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：14JCQNJC15000）。

作者簡(jiǎn)介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，碩士，講師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：lihui@tjau.edu.cn。

通信作者：閻國(guó)榮，博士，教授，主要從事植物資源學(xué)研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。

自然界中植物種類(lèi)繁多、形態(tài)各異，其中器官大小是造成植物形態(tài)多樣性的主要因素之一。不同植物間器官大小可能存在顯著差異，但就同一物種內(nèi)相同基因型的不同植物個(gè)體而言，在相同的生長(zhǎng)環(huán)境下它們的器官大小基本一致，表明植物各器官最終大小的形成受到嚴(yán)格的遺傳調(diào)控[1]。因此，近年來(lái)從不同植物中挖掘參與器官大小發(fā)育調(diào)控的基因或轉(zhuǎn)錄因子并揭示其調(diào)控機(jī)制的研究備受關(guān)注，并已在擬南芥和一些農(nóng)作物如水稻、玉米、油菜、番茄、馬鈴薯等中取得了長(zhǎng)足的研究進(jìn)展[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在外界生長(zhǎng)條件一致的情況下，植物各器官的最終大小在細(xì)胞水平上受細(xì)胞數(shù)量和大小的協(xié)同控制[3]。因此，分離、克隆參與調(diào)控植物細(xì)胞數(shù)量和大小的基因并闡釋其功能是揭示植物器官大小發(fā)育控制機(jī)制的關(guān)鍵。目前，在擬南芥等草本植物中已有多個(gè)相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被成功分離和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通過(guò)正向調(diào)控細(xì)胞增殖能力控制器官內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而影響器官大小。這些基因的異位過(guò)表達(dá)可通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞增殖時(shí)間導(dǎo)致植物器官變大，而突變則會(huì)導(dǎo)致植株器官整體變小。另外，還有一些基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞大小來(lái)影響器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中擬南芥中EBP1被證實(shí)對(duì)植物細(xì)胞數(shù)量和大小均能發(fā)揮正向調(diào)控作用[12]。擬南芥EBP1是和人類(lèi)的ErbB-3表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白同源的一個(gè)基因，與核糖體的生物合成相關(guān)，該基因在進(jìn)化上具有較高的保守性。目前除在擬南芥外，在沙冬青和馬鈴薯中也有該基因序列的相關(guān)報(bào)道，但該基因在其他植物中的功能仍未知，特別是在木本植物中，尚未有該基因的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究對(duì)楊樹(shù)中EBP1基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。相關(guān)研究對(duì)進(jìn)一步揭示楊樹(shù)EBP1的功能具有重要意義，同時(shí)對(duì)采用基因工程等手段提高林木產(chǎn)量和品質(zhì)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑楊（Populus nigra），種植于南開(kāi)大學(xué)校園內(nèi);pEASY-T1載體，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物表達(dá)載體pBI121、農(nóng)桿菌LBA4404，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 黑楊總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用改良的CTAB法提取黑楊葉片總RNA，以O(shè)ligo dT（18）為逆轉(zhuǎn)錄引物，在 M-MLV 作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及同源克隆 以擬南芥及其他草本植物中已經(jīng)報(bào)道的EBP1基因DNA及cDNA序列為種子序列，利用Blast序列比對(duì)軟件搜索楊樹(shù)基因組及EST數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得楊樹(shù)中候選EBP1基因序列。隨后根據(jù)篩選、獲得的楊樹(shù)中EBP1候選序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。進(jìn)一步對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的楊樹(shù)EBP1相關(guān)EST序列進(jìn)行分析，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，對(duì)楊樹(shù)中EBP1基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行克隆及序列分析。

1.2.3 楊樹(shù)EBP1表達(dá)載體構(gòu)建及分子鑒定 根據(jù)已獲得的楊樹(shù)EBP1候選基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增引物，對(duì)EBP1全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增及 T-A 克隆。挑取含有楊樹(shù)EBP1全長(zhǎng)cDNA的陽(yáng)性克隆，放大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切獲得帶有黏性末端的EBP1全長(zhǎng)cDNA序列。進(jìn)而與經(jīng)過(guò)相同雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121采用T4連接酶進(jìn)行連接，最終獲得EBP1重組表達(dá)載體。將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在LB+卡那霉素（Kan）板上篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR和酶切驗(yàn)證，進(jìn)而獲得插入方向和序列完全正確的陽(yáng)性克隆。隨后將該陽(yáng)性克隆放大培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑提取重組質(zhì)粒，并采用凍融法將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在YEB+鏈霉素（str）+利福平（Rif）板上篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)EBP1基因的克隆

根據(jù)序列同源性分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物對(duì)EBP1-1F：5′-ATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和 EBP1-1R：5′-TTCCTAGACGGCGGTGG-3′，以黑楊cDNA為模板對(duì)楊樹(shù)中EBP1候選基因進(jìn)行克隆。擴(kuò)增結(jié)果顯示，黑楊中EBP1候選基因全長(zhǎng)cDNA約為1.2 kb（圖1）。將獲得的cDNA通過(guò)T-A克隆方法，連入pEASY-T載體，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，楊樹(shù)中EBP1基因全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)度為1 215 bp，將其命名為PtEBP1。

2.2 楊樹(shù)PtEBP1的生物信息學(xué)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)獲得的PtEBP1進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析。同源性比對(duì)結(jié)果顯示，PtEBP1與已報(bào)道的沙冬青和馬鈴薯EBP1基因具有較高的同源性，其中與沙冬青EBP1蛋白序列的同源性為89%，與馬鈴薯EBP1蛋白同源性為87%（圖2）。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示PtEBP1含有1個(gè)PA2G4-like-domain，這個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏PP_MetAP超家族（圖3）。由此推測(cè)楊樹(shù)PtEBP1基因應(yīng)屬于轉(zhuǎn)錄因子APP_MetAP超家族的一個(gè)成員。

2.3 PtEBP1表達(dá)載體的構(gòu)建

為對(duì)PtEBP1的功能及作用機(jī)制進(jìn)行探究，本試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)PtEBP1植物表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。首先通過(guò)對(duì)PtEBP1的序列分析，結(jié)合pBI121載體酶切位點(diǎn)信息，確定選用XbaⅠ和SacⅠ對(duì)pBI121載體進(jìn)行切割;隨后設(shè)計(jì)帶有XbaΙ和SacⅠ切割序列的引物PtEBP1-F：5′-TCTAGAATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和PtEBP1-R：5′-GAGCTCCTAGACGGCGGTGG-3′用于擴(kuò)增PtEBP1，將擴(kuò)增序列通過(guò)T-A克隆方法導(dǎo)入pEASY-T1質(zhì)粒，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切消化處理后，獲得帶有雙酶切位點(diǎn)的目的片段，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pBI121的載體進(jìn)行連接（圖4）。

上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，PCR檢測(cè)顯示陽(yáng)性重組克隆中含有1.2 kb的目的片段;陽(yáng)性重組克隆進(jìn)一步經(jīng)過(guò)XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后也能產(chǎn)生1.2 kb的目的片段（圖5）。這表明楊樹(shù)EBP1基因已成功構(gòu)建入植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBI121中。

2.4 農(nóng)桿菌LBA4404中表達(dá)載體的菌液PCR鑒定

采用凍融法將已構(gòu)建好的表達(dá)載體pBI121-PtEBP1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（LBA4404）感受態(tài)細(xì)胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為1.2 kb（圖6），證明表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

3 結(jié)論與討論

EBP1是擬南芥中和人類(lèi)ErbB-3表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白同源的一個(gè)基因，與核糖體的生物合成有關(guān)，可以同時(shí)控制細(xì)胞的分裂和延伸，從細(xì)胞數(shù)量和體積2個(gè)方面同時(shí)調(diào)控植物器官大小。EBP1基因以劑量依賴(lài)型方式調(diào)節(jié)植物器官大小，同時(shí)也以生長(zhǎng)素依賴(lài)形式對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子進(jìn)行調(diào)控[12]，該基因與蛋白合成密切相關(guān)，并參加調(diào)控細(xì)胞周期，在調(diào)節(jié)植物器官大小方面具有重要意義。

楊樹(shù)是重要的用材和綠化樹(shù)種，具有經(jīng)濟(jì)和生態(tài)雙重價(jià)值。但和其他絕大多數(shù)木本植物一樣，楊樹(shù)生長(zhǎng)周期也較長(zhǎng)，遺傳背景復(fù)雜，很難在短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出大量突變體。因此，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)楊樹(shù)等木本植物器官形態(tài)建成及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制等基本問(wèn)題的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于擬南芥等草本植物。而2006年楊樹(shù)全基因組測(cè)序的完成[21]及隨后不斷豐富完善的楊樹(shù)及其近源種的EST數(shù)據(jù)信息，為采用生物信息學(xué)手段結(jié)合反向遺傳學(xué)策略探究楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制等基本問(wèn)題提供了一條有效途徑。

本研究通過(guò)克隆獲得的楊樹(shù)PtEBP1基因應(yīng)屬于轉(zhuǎn)錄因子APP_MetAP超家族的一個(gè)成員。通過(guò)蛋白同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)PtEBP1與已報(bào)道的與沙冬青、馬鈴薯的EBP1蛋白同源性高達(dá)89%、87%。同時(shí)，本研究已將楊樹(shù)PtEBP1基因構(gòu)建入植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBI121中，并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，為進(jìn)一步開(kāi)展楊樹(shù)中EBP1類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的功能研究、深度解析楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)勢(shì)形成的分子基礎(chǔ)奠定了重要的基礎(chǔ)。

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