馬霖+杜春華+成光輝+孫迎姣

摘要：以稗草、反枝莧為材料，采用小杯法測定澤漆葉乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇組分的除草活性。以蘋果腐爛病菌、白菜灰霉病菌、柑橘炭疽病菌、小麥全蝕病菌為供試病菌，采用菌絲生長速率法測定3種萃取物的抑菌活性。結(jié)果表明，澤漆葉乙酸乙酯萃取物對反枝莧幼苗的胚根、胚軸生長都有較好的抑制作用。當(dāng)濃度為 0.75 mg/mL 時，乙酸乙酯萃取物對反枝莧胚根、胚軸的抑制率分別為94.96%、88.93%，抑制效果明顯好于澤漆葉乙醇粗提物。乙酸乙酯萃取物對稗草的胚根生長也有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：澤漆葉萃取物;除草活性;抑菌活性

中圖分類號： S482.2+93;S482.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0154-02

收稿日期：2014-11-21

基金項(xiàng)目：山東省高校科技計(jì)劃（編號：J11LC21）;山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金（編號：BS2009NY006）;青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才基金（編號：630714）。

作者簡介：馬 霖（1990—），碩士，從事綠色化學(xué)工藝研究。

通信作者：杜春華，博士，副教授，主要從事天然源生理活性物質(zhì)開發(fā)、環(huán)境友好劑型及綠色化學(xué)工藝研究。E-mail：dch1218@163.com。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)植物次生代謝產(chǎn)物超過40萬種[1]，其中一些具有殺蟲、除草、抑菌等作用。相對于化學(xué)農(nóng)藥而言，植物源農(nóng)藥因具有高環(huán)保性、作用方式多樣、易光解、無殘留等特點(diǎn)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的理想農(nóng)藥。研究者已從植物中分離出眾多高活性化合物，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，從而開發(fā)出新農(nóng)藥[2]。從印楝中分離出的印楝素在殺蟲應(yīng)用方面有巨大應(yīng)用潛力[3]。從銀杏中分離出的高活性化合物已被開發(fā)成農(nóng)用殺菌劑等[4]。澤漆別稱貓眼兒草、五朵云，是大戟科大戟屬植物，長期以來一直作為草藥使用。澤漆具有化痰、消腫、抑制惡性腫瘤、殺蟲等功效[5]。澤漆含有多種化學(xué)成分，如萜類、黃酮類、苯丙素類、多酚類等[6]。近些年，關(guān)于澤漆殺蟲、抑菌的報道較多。如澤漆甲醇提取物對稻瘟菌的抑制作用較好[7];澤漆乙酸乙酯粗提物對小麥赤霉菌、番茄早疫病菌、蘋果炭疽病菌、葡萄白腐病菌也有較好的抑制作用[8]。關(guān)于澤漆除草活性研究較少。邢小霞等研究了澤漆各器官乙醇提取物的農(nóng)藥活性，結(jié)果表明，澤漆濃度為10 mg/mL時，澤漆葉乙醇提取物對反枝莧、葉用萵苣、稗草、小麥幼苗幼莖生長的抑制率在40%以上，對幼根的抑制率達(dá)78%以上，對番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌都有一定的抑制作用[9]。本研究對活性較高的澤漆葉乙醇提取物進(jìn)行萃取分離，并利用生物測定方法對萃取物進(jìn)行活性跟蹤，以期為開發(fā)植物源除草劑、殺菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

澤漆采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。將葉子摘下后晾干，粉碎。供試雜草稗草（Echinochloa crusgalli）、反枝莧（Amaranthus retroflexus）均采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。供試菌種為蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、白菜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioides）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水環(huán)式真空泵、真空干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、25 mL燒杯、無菌操作臺、直徑6 cm的培養(yǎng)皿、移液槍、微波爐。

1.3 方法

1.3.1 澤漆萃取物的制備 將粉碎的澤漆葉放入廣口瓶中，用85%乙醇水溶液浸泡3次，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，最后放入57 ℃真空干燥箱中干燥3 d，得浸膏。將得到的浸膏加入一定量的水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并萃取液，萃取后剩余物則為水相。減壓濃縮后，放入50 ℃真空干燥箱中干燥，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

1.3.2 除草活性的測定 將反枝莧、稗草種子用流水沖3 h，在培養(yǎng)皿底部放1張濾紙，用蒸餾水浸濕，將種子平鋪在濾紙上，放在26 ℃培養(yǎng)箱中避光保濕催芽。稱0.5 g瓊脂，加熱溶于蒸餾水中，配成0.5%瓊脂水溶液。將3種萃取物用乙醇溶解，與0.5%瓊脂水溶液混合，配成濃度為0.75 mg/mL的帶毒基質(zhì)，分別倒入3個小燒杯中，對照燒杯加入等量乙醇。每個小燒杯中接入10粒長勢一致的露白種子，放入 26 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)。72 h后測量種子胚根及胚軸長度，計(jì)算萃取物對胚根、胚軸的抑制率。將抑制效果較好的待測物配成一系列濃度，測定其在不同濃度下的除草活性，并進(jìn)行毒力回歸分析，得到EC50值。

抑制率=（對照長度-處理長度）/對照長度×100%。

（1）

1.3.3 抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法[10]測定3種萃取物對病原菌的抑制率。稱取一定量的3種萃取物，用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮水溶液溶解成濃度為75 mg/mL的溶液，將PDA培養(yǎng)基溶解，吸取1 mL樣品溶液加入149 mL已溶解的PDA中，樣品最終濃度為0.50 mg/mL。將含藥PDA倒入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，每菌每樣重復(fù)3次，對照組在PDA中加入等量體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮水溶液。將菌餅菌絲朝下接種于培養(yǎng)基中央，放入27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照快長滿時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

純生長量=測量直徑-菌餅直徑。

（2）

抑菌率=（對照組純直徑-處理組純直徑）/對照組純生長量×100%。

（3）

2 結(jié)果與分析

2.1 澤漆葉不同溶劑萃取物對反枝莧、稗草的抑制作用

由表1可以看出，在0.75 mg/mL濃度下，澤漆葉的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物對反枝莧、稗草都有一定的抑制作用。其中乙酸乙酯萃取物的抑制效果最好，對反枝莧的胚根、胚軸的抑制率分別為94.96%、88.93%，對稗草胚根抑制率為74.53%。正丁醇萃取物對三者的抑制率均在50%以上。3種提取物除對稗草胚軸無明顯抑制作用，表現(xiàn)出作用器官的的選擇性。endprint

表1 澤漆葉不同溶劑萃取物對反枝莧和稗草胚根、胚軸的抑制率

樣品

抑制率（%）

反枝莧 稗草

胚根 胚軸 胚根

石油醚萃取物 42.79 18.26 2.94

乙酸乙酯萃取物 94.96 88.93 74.53

正丁醇萃取物 84.89 59.98 52.94

2.2 澤漆葉不同濃度萃取物的除草活性

依據(jù)初測結(jié)果，將3種萃取物用乙醇溶解，稀釋成不同濃度，分別加入瓊脂水溶液中，萃取物濃度分別為3.000、1.500、0.750、0.375、0.187 mg/mL，接入反枝莧、稗草種子后測定除草活性。由表2可知，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對反枝莧胚軸生長抑制作用的EC50值分別為0.35、0.52 mg/mL。表3表明，這2種萃取物對反枝莧胚根生長抑制作用的EC50值僅為0.21、0.31 mg/mL。

表2 澤漆葉不同溶劑萃取物對反枝莧胚軸生長的毒力回歸分析

樣品 回歸方程 r2 EC50值

（mg/mL）

石油醚萃取物 y=-0.630 9+1.711 6x 0.98 1.95

乙酸乙酯萃取物 y=-4.277 9+3.653 1x 0.98 0.35

正丁醇萃取物 y=-0.153 3+1.896 7x 0.99 0.52

表3 澤漆葉不同溶劑萃取物對反枝莧胚根生長的毒力回歸分析

樣品 回歸方程 r2 EC50值

（mg/mL）

石油醚萃取物 y=0.248 0+1.630 2x 0.93 0.82

乙酸乙酯萃取物 y=-1.660 6+2.868 8x 0.94 0.21

正丁醇萃取物 y=-0.317 6+2.137 4x 0.97 0.31

從表4可以看出，3種萃取物對稗草胚根的影響較弱，乙酸乙酯萃取物EC50值最小，僅為0.70 mg/mL。由此可知，石油醚萃取物的除草活性最弱，EC50值遠(yuǎn)大于其他2種萃取物。

2.3 澤漆葉不同溶劑萃取物的抑菌活性

由表5可以看出，3種萃取物對蘋果腐爛病菌、柑橘炭疽

表4 澤漆葉不同溶劑萃取物對稗草胚根生長的毒力回歸分析

樣品 回歸方程 r2 EC50值

（mg/mL）

石油醚萃取物 y=-8.182 7+3.990 6x 0.94 2.01

乙酸乙酯萃取物 y=-6.962 2+4.208 0x 0.95 0.70

正丁醇萃取物 y=-6.127 4+3.786 5x 0.98 0.87

病菌都有一定的抑制作用。乙酸乙酯萃取物抑制作用最好，對蘋果腐爛病菌、柑橘炭疽病菌的抑制率分別為41.24%、32.17%，其次是石油醚萃取物，對蘋果腐爛病菌、柑橘炭疽病菌的抑制率分別為30.28%、22.03%。3種萃取物對白菜灰霉病菌、小麥全蝕病菌的抑制作用都較差。

表5 澤漆葉不同溶劑萃取物對4種真菌的抑菌活性

樣品

抑制率（%）

蘋果腐

爛病菌 白菜灰

霉病菌 柑橘炭

疽病菌 小麥全

蝕病菌

石油醚萃取物 30.28 8.76 22.03 8.28

乙酸乙酯萃取物 41.24 19.32 32.17 22.82

正丁醇萃取物 15.74 9.96 29.04 7.16

3 結(jié)論

本研究采用小杯法測定澤漆葉乙醇提取物不同溶劑萃取物對反枝莧、稗草的除草活性，結(jié)果表明，澤漆葉乙酸乙酯萃取物對反枝莧幼苗的胚根、胚軸生長都有較好的抑制作用。當(dāng)濃度為0.75 mg/mL時，乙酸乙酯萃取物對反枝莧胚根、胚軸的抑制率分別為94.96%、88.93%，抑制效果明顯好于澤漆葉乙醇粗提物。乙酸乙酯萃取物對稗草的胚根生長也有一定的抑制作用。同時乙酸乙酯萃取物表現(xiàn)出較好的抑真菌活性，說明澤漆葉的除草、抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物，且活性成分主要為中等極性物質(zhì)。

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