黎麗 陳春帆 梁韜 蘇敏

(1.環(huán)境監(jiān)測站，廣西北流市環(huán)保局，廣西 北流 547400；2.環(huán)境監(jiān)察大隊，廣西北流市環(huán)保局，廣西 北流 547400；3.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 533000；4.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021)

汞暴露所致小鼠腎毒性的實驗研究

黎麗1陳春帆2梁韜4蘇敏3△

(1.環(huán)境監(jiān)測站，廣西北流市環(huán)保局，廣西 北流 547400；2.環(huán)境監(jiān)察大隊，廣西北流市環(huán)保局，廣西 北流 547400；3.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 533000；4.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021)

目的：研究氯化汞暴露對小鼠腎臟器官及生理功能的影響，并探討其分子機制。方法：挑選健康雄性KM小鼠隨機分為正常對照組(n=8)及低、中、高氯化汞染毒組(ig，1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1，n=8)。2周后，計算小鼠體重和腎臟指數(shù)變化，檢測24 h尿蛋白含量和ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6的濃度。同時，應用Western blotting法測定腎臟組織內(nèi)源性NF-κBp50表達。結(jié)果：與正常對照組比較，不同濃度的氯化汞染毒小鼠均出現(xiàn)明顯的體重減輕和腎臟器官腫大(P<0.01)，24 h尿蛋白含量明顯升高(P<0.01)，血清TNF-α、IL-6的濃度顯著增高(P <0.01)。而腎臟組織NF-κBp50蛋白表達也顯著上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論：金屬汞暴露明顯誘導小鼠腎臟細胞發(fā)生毒性損傷，其機理可能與病理性炎癥應激有關(guān)。

氯化汞；腎毒性；炎癥應激

隨著近年經(jīng)濟發(fā)展，人類生產(chǎn)活動造成環(huán)境來源的汞污染，這些污染源經(jīng)過生物降解和生物鏈傳送會將重金屬汞帶入體內(nèi)，造成神經(jīng)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)等傷害[1]。重金屬汞中毒的臨床表現(xiàn)，主要是為頭暈、肢體疼痛及麻木、運動失調(diào)等神經(jīng)癥狀，同時伴有腎炎、肝炎、蛋白尿、血尿和尿毒癥等器官損傷病癥[2,3]。因此，積極制定防治措施對汞污染管理至關(guān)重要。而實施相關(guān)的金屬汞生物學研究，對其損傷機體器官的機理探討也將會促進醫(yī)療防護及藥物治療的進一步發(fā)展。本研究擬體內(nèi)復制汞中毒小鼠模型，探究氯化汞對腎臟排泄系統(tǒng)的影響及討論損傷分子機理，為對汞毒性研究提供一定的科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

健康雄性KM小鼠，體重20±2 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗小鼠飼養(yǎng)于符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施要求的飼養(yǎng)環(huán)境中。試驗動物使用許可證SCXK(桂)2007-0001。

1.1.2 藥物與試劑

氯化汞(分析純)：貴州省銅仁化學試劑廠。尿蛋白檢測試劑盒和ELISA(TNF-α、IL-6)試劑盒：南京建成生物工程研究所。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2X)：上海碧云天生物技術(shù)研究所。預染蛋白Marker：美國Santa Cruz Biotechnology公司。兔抗鼠NF-κB p50多克隆抗體：美國Santa Cruz Biotechnology公司。辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG抗體：上海碧云天生物技術(shù)研究所。超敏ECL化學發(fā)光試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 主要儀器

5810型高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)。722S紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限責任公司)。酶免分析儀(美國Thermo Forma公司)。垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立氯化汞染毒小鼠模型[4]

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，每天罐胃(ig)給予不同濃度的氯化汞溶液(1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1)，持續(xù)至第14天。

1.2.2 指標檢測

末次染毒12 h后，收集小鼠尿液后麻醉(ip，10%水合氯醛)并脫頸椎處死小鼠，分離左側(cè)腎臟并稱量，計算腎臟指數(shù)=腎濕重/體重。生化試劑盒檢查24小時蛋白尿含量，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6的濃度。同時，應用Western blotting法測定腎臟組織內(nèi)源性NF-κB p50表達。

1.2.3 Western blotting檢測[5]

準確稱量5 mg腎臟組織，加入500 μl RIPA裂解液低溫提取目標蛋白。經(jīng)考馬斯亮藍檢測蛋白含量后，取200 ng蛋白在110 V電壓下進行SDS-PAGE蛋白分離，再經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜，加入脫脂奶粉溶液于搖床孵育1 h。經(jīng)TBST洗滌3次后，加入稀釋后的NF-κB p50一抗(1：1000)于室溫2 h，隨后加入稀釋后的二抗(1：4000)于室溫2 h。經(jīng)TBST洗去抗體后，進行ELC化學發(fā)光反應，然后于暗房進行對膜蛋白的顯影。對膠片顯示的條帶進行掃描并采集照片，最后計算目標泳道蛋白的相對密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 生命體征表現(xiàn)

實驗觀察顯示，氯化汞染毒小鼠精神萎靡，尿量增多生長緩慢及體重明顯減輕(P<0.01)。與正常組腎臟比較，氯化汞損傷的腎臟組織有不同程度的損傷癥狀，如淤血腫大、組織粘連、萎縮等，而腎指數(shù)明顯增加(P<0.01)，見表1。

表1 氯化汞染毒小鼠體重與腎指數(shù)的變化±SD, n=8)

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

2.2 氯化汞染毒小鼠尿蛋白含量增加

檢測結(jié)果顯示，氯化汞染毒小鼠明顯升高尿液中蛋白的含量，其濃度均高于正常對照(P<0.01)。此外，增加的趨勢表現(xiàn)為劑量依賴方式，見表2。

表2 氯化汞染毒小鼠24h蛋白尿的變化

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

2.3 氯化汞染毒小鼠血清TNF-α、IL-6水平增加

血清學檢查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，氯化汞染毒小鼠血液中的促炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯升高，其含量均多于正常對照(P<0.01)，見表3。

表3 氯化汞染毒小鼠血清TNF-α、IL-6含量的變化

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

2.4 氯化汞染毒小鼠腎臟中NF-κB p50蛋白上調(diào)

由Western blotting檢測數(shù)據(jù)表明，氯化汞染毒小鼠腎臟組織中內(nèi)源性NF-κB p50蛋白表達明顯增加，其水平均高于正常對照(P<0.01)。此外，上調(diào)的趨勢表現(xiàn)為劑量依賴方式，見表4。

表4 氯化汞染毒小鼠腎臟中NF-κB p50蛋白表達的變化

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

3 討論

近年來，由于社會活動而導致環(huán)境中的重金屬濃度逐漸上升，并超出閾值范圍，其結(jié)果會直接危害人體健康及導致環(huán)境生態(tài)惡化[6]。其中重金屬汞及其化合物被歸納劇毒物質(zhì)，進入生態(tài)系統(tǒng)后經(jīng)積累、遷移于人體內(nèi)蓄積誘發(fā)臨床病癥[7]。因此，我們應該重視了解重金屬對人類及環(huán)境所造成的潛在危害，同時提高環(huán)保意識。此外，開展科學實驗研究重金屬對體內(nèi)的毒性機制可為醫(yī)療防護及藥物研發(fā)提供新思路。本實驗成功建立氯化汞染毒小鼠模型，進而重金屬汞離子對體內(nèi)臟器的毒性分子機理。結(jié)果顯示氯化汞染毒小鼠體重減輕，腎臟腫大及明顯升高的尿蛋白，表明金屬汞進入體內(nèi)后影響營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用，腎腫大則提示金屬汞損傷腎細胞。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種經(jīng)典的促炎癥細胞因子。作為內(nèi)源性致熱原，其負調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細胞的功能[8]。炎癥發(fā)生時，TNF-α常常會發(fā)生異常表達。細胞因子白介素6(IL-6) 參與激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，同時在炎癥反應中起重要的促進作用[9]。因此，體內(nèi)的促炎癥細胞因子的表達情況可以反映機體的炎癥應激病情。實驗發(fā)現(xiàn)，氯化汞染毒小鼠血清中TNF-α、IL-6含量較正常對照有著明顯的升高趨勢，提示炎癥因子的異常增多可能來自損傷腎組織的釋放，其實驗結(jié)果與尿蛋白上升及腎腫大相符合。我們推測汞離子損傷腎細胞結(jié)構(gòu)，促使組織免疫調(diào)控失調(diào)而造成炎癥因子積累，進一步加重腎損傷。

生理功能上，核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)指DNA轉(zhuǎn)錄蛋白復合體，其主要作用是參與靶細胞對外源應激、細胞因子、自由基等生理反應[10]。一旦細胞內(nèi)NF-κB調(diào)控失常，將快速啟動對炎癥應激，加重細胞損傷。生理機制上，激活的NF-κB經(jīng)脫離復合體后轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并特異性結(jié)合到DNA的反應元件序列，啟動下游效應蛋白的事件，如炎癥反應和免疫攻擊[11]。實驗發(fā)現(xiàn)，氯化汞染毒小鼠腎臟組織中內(nèi)源性的NF-κB 50蛋白明顯上調(diào)，提示金屬汞激活了腎臟細胞NF-κB炎癥通路，并誘導炎癥因子基因編程，造成炎癥因子的釋放，其結(jié)果與血清增高的促炎癥因子水平相符合。因此，我們推測氯化汞誘導的腎毒性與激活NF-κB炎癥通路相關(guān)，從而造成腎臟細胞損傷。

1 Cordy P, Veiga MM, Salih I, et al. Mercury contamination from artisanal gold mining in Antioquia, Colombia:The world′s highest per capita mercury pollution[J]. Sci Total Environ, 2011, 410(2):154-160.

2 Chan TY. Inorganic mercury poisoning associated with skin-lightening cosmetic products[J]. Clin Toxicol(Phila), 2011, 49(10):886-891.

3 Kosnett MJ. The role of chelation in the treatment of arsenic and mercury poisoning[J]. J Med Toxicol, 2013, 9(4):347-354.

4 Liu WY, Shen SL, Li HY, et al. Fluorescence turn-on chemodosimeter for rapid detection of mercury(II) ions in aqueous solution and blood from mice with toxicosis[J]. Anal Chim Acta, 2013, 791(8):65-71.

5 Li R, Liang T, Li Y, et al. Effects of l-dopa methyl ester on visual cortex injury induced by amblyopia and its underlying mechanism[J]. Neurosci Lett, 2012, 508(2):95-100.

6 Rice KM, Walker EM Jr, Wu M, et al. Environmental mercury and its toxic effects[J]. J Prev Med Public Health, 2014, 47(2):74-83.

7 D ez S. Human health effects of methylmercury exposure[J]. Rev Environ Contam Toxicol, 2009, 198(2):111-132.

8 Vigerust NF, Bjrndal B, Bohov P, et al. Krill oil versus fish oil in modulation of inflammation and lipid metabolism in mice transgenic for TNF-α[J]. Eur J Nutr, 2013, 52(4):1315-1325.

9 Leppkes M, Roulis M, Neurath MF, et al. Pleiotropic functions of TNF-α in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation[J]. Int Immunol, 2014, 26(9):509-515.

10 Li X, Massa PE, Hanidu A, et al. IKKalpha, IKKbeta, and NEMO/IKKgamma are each required for the NF-kappa B-mediated inflammatory response program[J]. J Biol Chem, 2002, 277(47):45129-45140.

11 DiDonato JA, Mercurio F, Karin M. NF-κB and the link between inflammation and cancer[J]. Immunol Rev, 2012, 246(1):379-400.

Experimental study of mercury exposure-induced renal toxicity in mice

Li Li1, Chen Chun-Fan2, Liang Tao4, Su Min3△

(1.Environmental Monitoring Stations Municipal Environmental Protection Bureau of Beiliu of Guangxi, 547400;2.Environmental Monitoring Unit, Municipal Environmental Protection Bureau of Beiliu of Guangxi, 547400;3.Guilin Medical College, Guangxi Guilin 541004;4.Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021)

Objective：To study the effects of mercury bichloride exposure on kidney tissue and physiological functions in mice, and to explore the molecular mechanism. Methods: Selection of healthy male KM mice were randomly divided into four groups:normal control group(n=8) and the low, medium and high mercuric chloride-treated groups(ig, 1 mg·kg-1, 5 mg·kg-1, 10 mg·kg-1; n=8). At the end of 2 weeks, body mass and kidney index of mice were measured; 24 h proteinuria content was detected, and serum concentrations of TNF-α, and IL-6 were determined using ELISA method; in addition, endogenous NF-κBp50 expression in the kidney was assessed by Western blotting assay. Results: Compared with normal control, treatment with different concentrations of mercuric chloride in mice showed marked weight loss and kidney enlargement(P<0.01); 24 h proteinuria concentration was significantly elevated(P<0.01); serum TNF-α, IL-6 concentrations were increased(P<0.01); intrarenal NF-κBp50 protein expression was also significantly upregulated(P<0.01). Conclusions: Metallic mercury exposure significantly induced cytotoxicity in renal cells, which the mechanism may be related to development of pathological inflammatory stress.

Mercury bichloride; Renal toxicity; Inflammatory stress

黎麗，女，助理工程師，主要從事環(huán)境監(jiān)測和污染物處理，Email：lili_beiliu@163.com。

△通訊作者：蘇敏，女，講師，主要從事機體毒理與藥理學，Email：sumin_guilin@163.com。

2015-1-18)