李勇 鄭筠 黨亞正 陸婉玲 劉軍 齊濤

(1. 解放軍第323醫(yī)院腫瘤中心， 陜西 西安 710054；2. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830000)

氫氧化鈉抑制原位移植性肝癌生長(zhǎng)機(jī)制研究*

李勇1鄭筠2黨亞正1陸婉玲1劉軍1齊濤1

(1. 解放軍第323醫(yī)院腫瘤中心， 陜西 西安 710054；2. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探討氫氧化鈉溶液瘤內(nèi)注射對(duì)原位肝癌的生長(zhǎng)抑制作用，研究抵抗肝癌生長(zhǎng)的臨床機(jī)制。方法 獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed的人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，進(jìn)行不同濃度氫氧化鈉溶液刺激，并使用原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。建立裸鼠原位肝癌模型，于第7天進(jìn)行不同濃度氫氧化鈉溶液原位瘤內(nèi)注射，利用小動(dòng)物活體熒光成像技術(shù)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)殘存腫瘤組織中VEGF表達(dá)，并使用TUNEL法檢測(cè)瘤體內(nèi)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 氫氧化鈉溶液刺激肝癌細(xì)胞后，顯著增加細(xì)胞凋亡比例。成功建立裸鼠原位肝癌模型并進(jìn)行氫氧化鈉溶液注射。在熒光成像系統(tǒng)下，激發(fā)光波長(zhǎng)570nm,發(fā)射波長(zhǎng)610nm，于細(xì)胞接種后第21天觀測(cè)到發(fā)紅色熒光的腫瘤。取肝臟進(jìn)行原位瘤體積測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水瘤內(nèi)注射相比，氫氧化鈉顯著抑制了原位瘤生長(zhǎng)并引起瘤組織壞死。氫氧化鈉抑制了瘤體中VEGF的表達(dá)，并增加了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)比例。結(jié)論 氫氧化鈉瘤內(nèi)注射有效抑制裸鼠原位肝癌生長(zhǎng),這可能是通過(guò)抗血管生成作用和誘導(dǎo)凋亡作用實(shí)現(xiàn)的。

肝細(xì)胞肝癌； 氫氧化鈉； VEGF； TUNEL

肝癌在我國(guó)惡性腫瘤中的發(fā)病率及死亡率均居前三位，到目前為止仍以外科治療為主，但臨床上大多數(shù)病人在就診時(shí)，病期已屬中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。經(jīng)皮瘤內(nèi)藥物注射(percutaneous anti-cancer agents injection,PACAI)已在晚期肝癌患者中廣泛應(yīng)用。本研究前期試驗(yàn)表明，氫氧化鈉的消融作用優(yōu)于無(wú)水乙醇和乙酸，但低濃度氫氧化鈉抑制肝癌原位生長(zhǎng)的機(jī)制仍不清楚。本研究將進(jìn)一步對(duì)氫氧化鈉抵抗肝癌原位生長(zhǎng)的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 試劑氫氧化鈉(NaOH)根據(jù)試驗(yàn)需要由生理鹽水配置成0.5%、1%溶液，和生理鹽水均采用高溫滅菌。免疫熒光專(zhuān)用Dish購(gòu)自Matrigel，基質(zhì)膠來(lái)自BD公司，TUNEL熒光法檢測(cè)試劑盒?(DeadEnd?Fluorometric TUNEL System)及比色法檢測(cè)試劑盒(DeadEnd?Colorimetric TUNEL System)均購(gòu)于Promega公司,VEGF抗體購(gòu)于SantaCruz公司。生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與NaOH處理后TUNEL染色 將DsRed-Neo載體轉(zhuǎn)染入人SMMC-7721 肝癌細(xì)胞系(來(lái)自中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光DsRed的7721-DsRed肝癌細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。7721-DsRed細(xì)胞于處理前24小時(shí)接種于免疫熒光專(zhuān)用Dish中(n=3)，經(jīng)生理鹽水或0.5%、1%NaOH溶液處理10分鐘后，利用TUNEL熒光法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。染色完成后，于倒置熒光顯微鏡下激發(fā)綠色熒光(TUNEL陽(yáng)性染色)，每只平皿于400倍鏡下隨機(jī)拍攝5個(gè)視野。細(xì)胞核使用DAPI進(jìn)行襯染。

1.2.2 裸鼠肝原位模型建立與分組處理 BALB/c雄性裸鼠購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，并于恒溫、恒濕的SPF級(jí)別動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。取4～6周齡BALB/c裸鼠，消毒裸鼠腹部皮膚，使用戊巴比妥麻醉。將3×106處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期7721-DsRed細(xì)胞與matrigel混勻形成細(xì)胞懸液。沿裸鼠左肋弓下緣切一長(zhǎng)約1cm斜行無(wú)菌切口，剝開(kāi)腹肌，暴露肝臟。抽取0.1ml細(xì)胞matrigel懸液，使針尖與裸鼠肝臟呈30°進(jìn)針，刺入肝臟約0.3cm，緩慢注入細(xì)胞懸液。注射完畢后，用明膠海綿壓迫止血30s；逐層縫合腹肌和皮膚。建立人肝癌細(xì)胞裸鼠肝原位轉(zhuǎn)移模型。

7天后戊巴比妥麻醉下開(kāi)腹探查，將裸鼠按照腫瘤大小分為三組，每組8只。①對(duì)照組瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1ml/只。②0.5% NaOH組瘤內(nèi)注射0.1ml/只。③1% NaOH組瘤內(nèi)注射0.1ml/只。2只裸鼠止血縫合后分籠飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 分別在細(xì)胞接種后第7、14、21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即瘤內(nèi)注射后第0、7、14天)對(duì)3組裸鼠進(jìn)行稱(chēng)重。接種后第21天麻醉各組裸鼠，分別使用小動(dòng)物活體熒光影像系統(tǒng)攝像觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。用游標(biāo)卡尺測(cè)量原位瘤長(zhǎng)短徑，計(jì)算原位瘤體積(V=長(zhǎng)徑×短徑2/2)。取原位殘存癌灶進(jìn)行石蠟包埋，制作切片備用。應(yīng)用免疫組化染色及TUNEL染色法，觀察裸鼠肝原位殘存癌灶癌細(xì)胞中VEGF表達(dá)及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。應(yīng)用Student’st檢驗(yàn)或One-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本或多樣本間統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外NaOH溶液處理后細(xì)胞凋亡情況 經(jīng)0.5%或1% NaOH溶液處理10分鐘后，7721-DsRed中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例0.5% NaOH組與生理鹽水組相比明顯增加(P<0.05)，1%NaOH組顯著增加(P<0.01)。TUNEL法檢測(cè)的凋亡細(xì)胞，其陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，呈彌漫性分布，見(jiàn)圖1。

圖1 NaOH溶液處理后TUNEL檢測(cè)結(jié)果。

Figure 1 The results of TUNEL assay for apoptosis detection in HCC cells treated with sodum hydroxide

注：A. 熒光顯微鏡下TUNEL染色情況。B.TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)。

2.2 裸鼠肝原位模型 NaOH處理后變化在接種瘤細(xì)胞后早期，各組裸鼠狀態(tài)良好。生理鹽水組原位瘤裸鼠出現(xiàn)皮膚干燥、消瘦、活動(dòng)減少及體重下降的現(xiàn)象，晚期可見(jiàn)裸鼠腹部高度膨隆，形體消瘦，呈惡病質(zhì)狀態(tài)。而0.5%、1%NaOH溶液組裸鼠體重?zé)o明顯改變，與生理鹽水組存在顯著差異(P<0.001)(見(jiàn)圖2A)。應(yīng)用小動(dòng)物熒光成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與PBS瘤內(nèi)注射組相比，0.5%、1% NaOH溶液注射后腫瘤明顯縮小(見(jiàn)圖2B)；原位瘤體積在各組間存在顯著差異(P<0.01),見(jiàn)圖2C。

圖2 NaOH溶液瘤內(nèi)注射對(duì)裸鼠肝原位成瘤影響

Figure 2 Orthotopic intrahepatic model of hepatocellular carcinoma

注：A. 各組裸鼠體重變化情況；B.體內(nèi)熒光成像代表性結(jié)果； C.各組原位瘤體積

2.3 VEGF與TUNEL表達(dá) 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，NaOH瘤內(nèi)注射顯著降低了壞死區(qū)周?chē)[瘤細(xì)胞中VEGF表達(dá)；TUNEL比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加，即NaOH瘤內(nèi)注射增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的凋亡,見(jiàn)圖3。

圖3 NaOH溶液瘤內(nèi)注射對(duì)原位瘤體VEGF表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3 Effects of sodum hydroxide on VEGF expression and cell apoptosis detected by immunohistochemistry and TUNEL assay

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表的《全球2014癌癥報(bào)告》，中國(guó)新增癌癥病例迅猛增長(zhǎng)，其中肝癌新增病例和死亡人數(shù)居世界首位[1]。其在全世界惡性腫瘤中發(fā)病率位于第五位，致死率在排在第三位，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤。肝細(xì)胞癌發(fā)展快、治療難度大、病死率較高[2]。

目前手術(shù)切和肝移植除仍然是治療肝癌的首先方法，但由于肝癌發(fā)病多隱匿，早期診斷率低，發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，常已無(wú)手術(shù)指征；同時(shí)受限于存在肝臟儲(chǔ)備不足、腫瘤直接侵犯門(mén)靜脈或肝靜脈、早期播散至鄰近器官或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素，總的手術(shù)率低于27%，且手術(shù)治療后五年復(fù)發(fā)率較高[3]。而經(jīng)皮肝癌瘤內(nèi)藥物注射作為治療肝癌的一種重要手段，Ohto首次報(bào)道因其較好的療效和簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的治療方法日益受到關(guān)注[4,5]。以往的肝癌瘤內(nèi)注射藥物主要包括無(wú)水乙醇和乙酸，但二者在治療過(guò)程中仍存在著對(duì)瘤灶的滲透能力弱 ,注射過(guò)程中引起患者疼痛的局限性[6～8]。文獻(xiàn)表明，NaOH溶液可作為理想的瘤內(nèi)注射藥物作用于肝癌，但相關(guān)的肝癌原位注射模型和具體抑瘤原理仍不明確[9,10]。

本研究通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)表明，較低濃度的NaOH溶液即能夠明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。TUNEL法是一種分子生物學(xué)與免疫組織化學(xué)相結(jié)合原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞方法，因其靈敏可靠而被廣泛用于細(xì)胞凋亡的研究[11]。在本研究中，0.5%、1%NaOH溶液處理肝癌細(xì)胞后在較短時(shí)間內(nèi)可以檢測(cè)出明顯的TUNEL陽(yáng)性染色，說(shuō)明較低濃度的NaOH溶液即可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，本研究使用的肝癌原位注射模型相對(duì)比體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下成瘤模型，能夠更好的模擬臨床體能環(huán)境；瘤組織具有較快的生長(zhǎng)速度、較強(qiáng)的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力[12]。裸鼠肝原位瘤內(nèi)注射N(xiāo)aOH溶液后，抑瘤效果明顯，瘤內(nèi)注射后形成局灶性肝癌壞死灶，表現(xiàn)出較好的安全性。VEGF是重要的血管生成因子，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中作用重要[13,14]。NaOH溶液瘤內(nèi)注射在形成局灶性壞死的同時(shí)，殘存的腫瘤細(xì)胞TUNEL表達(dá)增高，出現(xiàn)凋亡，而VEGF則明顯下調(diào)，腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，較低濃度的NaOH溶液肝原位瘤內(nèi)注射可以有效抑制肝癌生長(zhǎng)，安全性較高，有較廣泛的臨床應(yīng)用前景。其主要機(jī)制可能與直接的融瘤作用、誘導(dǎo)凋亡及抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

[1]Stewart BW, Wild CP. World Cancer Report 2014[M]. IARC Nonserial Publication, 2014.

[2]Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet， 2012，379(9822):1245-1255.

[3]Walther Z, Jain D. Molecular pathology of hepatic neoplasms:classification and clinical significance[J]. Patholog Res Int， 2011,403929.

[4]Ohto M, Karsawa E, Tsuchiya Y,etal. Ultrasonicqlly Guided Per-cutaneous Contrast Medium Injection and Aspiration Biopsy Using a Real-time Puncture Transducer[J]. Radiology, 1980,136(1):171-176.

[5]Ho CS, Kachura JR, Gallinger S,etal. Percutaneous ethanol injection of unresectable medium-to-large-sized hepatomas using a multipronged needle: efficacy and safety[J]. Cardiovasc Intervent Radiol，2007,30(2):241-247.

[6]Zuo CJ, Wang PJ, Shao CW,etal. CT-guided percutaneous ethanol injection with disposable curved needle for treatment of malignant liver neoplasms and their metastases in retroperitoneal lymph nodes[J]. World J Gastroenterol,2004,10(1):58-61.

[7]李新豐,呂國(guó)榮,李伯義,等.經(jīng)皮肝穿刺注射醋酸和乙醇治療原發(fā)性肝癌的臨床觀察[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2000,7(4):244-245.

[8]Giorgio A. Percutaneous ethanol injection in the treatment of hepatocellular carcinoma in cirrhosis：a simple，effective and cheap procedure for percutaneous ablation[J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2010,19(4):461-462.

[9]Jiang TA, Zhao QY, Chen MY,etal. Low-concentration sodium hydroxide solution injection in normal liver parenchyma of rabbits[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2005,4(2):285-290.

[10] Rao W, Liu J, Zhou YX,etal. Anti-tumor effect of sodium-induced thermochemical ablation therapy [J]. Int J Hyperthermia,2008,4(8):675-681.

[11] Cuello-Carrion FD, Ciocca DR. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique[J]. J Histochem Cytochem,1999,47(6):837-839.

[12] 張海英,李艷茹,王健君,等. 小鼠原位移植性肝癌模型的建立及生物學(xué)特性[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,35:5-8.

[13] Zhan P, Qian Q, Yu LK. Serum VEGF level is associated with the outcome of patients with hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Hepatobiliary Surg Nutr, 2013,2(4):209-215.

[14] Mukozu T, Nagai H, Matsui D,etal. Serum VEGF as a tumor marker in patients with HCV-related liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J]. Anticancer Res, 2013,33(3):1013-1021.

The mechanism of sodium hydroxide-inhibited growth of hepatocellular carcinoma in orthotopic intrahepatic model

LI Yong1, ZHENG Jun2, DANG Yazheng1,etal

(1.DepartmentofOncology,PLA323Hospital,Xi’an710054,China；
2.UrumqiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Urumqi830000,China)

Objective To investigate the effects of sodium hydroxide on hepatocellular carcinoma xenograft in an orthotopic intrahepatic model. Methods SMMC-7721 cells were transfected with a vector to establish a DsRed stably expressed cell line, named as 7721-DsRed. Cells were incubated with different doses of sodium hydroxide or normal saline followed by detection of apoptosis by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Nude mice bearing 7721-DsRed tumors in livers were injected with different doses of sodium hydroxide or normal saline at day 7 post injection. In vivo DsRed signal was monitored using a Kodak Image Station 4000MM PRO Digital Imaging System. The expression of VEGF and apoptosis in the periphery of the target were detected by immunohistochemistry and TUNEL assay respectively. Results Stimulation of sodium hydroxide significantly increased the percentage of apoptotic HCC cells. The orthotopic intrahepatic model of hepatocellular carcinoma was successfully established. DsRed signal of in situ tumors was detected at the indicated time points (day 21) (excitation and emission wavelengths were 570 and 610 nm respectively). Compared to control group, sodium hydroxide induced necrosis, significantly inhibited the size of in situ tumors and increased the weight of mice. Moreover, the expression of VEGF was suppressed and the percentage of apoptotic cells in tumors was increased. Conclusion By intratumoral injection with sodum hydroxide in the situ HCC tumors of orthotopic intrahepatic model, the growth of tumors was effectively suppressed. The underlying mechanism might be the inhibition of angiogenesis and the induction of apoptosis.

Hepatocellular carcinoma; NaOH; VEGF; TUNEL

陜西省自然科學(xué)基金(2010JM4053，2014JM4121)

黨亞正，《西部醫(yī)學(xué)》編委，E-mail:dangyz@live.com

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.07.006

2014-07-22； 編輯： 陳舟貴)