周文珍，馮 葳，黃正根，孟慶延

1.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連 116000;2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院燒傷科，遼寧沈陽 110016

隨意皮瓣因具有使用簡便靈活等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于燒傷、創(chuàng)傷、整形等多個(gè)領(lǐng)域。但是隨意皮瓣內(nèi)無明確知名血管，皮瓣術(shù)后部分壞死成為皮瓣移植中最常見的并發(fā)癥。為確保皮瓣的存活，在應(yīng)用中多遵循長：寬=(1.5～2)：1的原則，否則皮瓣遠(yuǎn)端易發(fā)生缺血再灌注損傷而壞死［1］。因此，改善皮瓣血流量及減輕缺血再灌注損傷，成為提高皮瓣存活率的主要研究方向。Ohsawa等［2］研究表明，2%氫可有效減小缺血再灌注損傷造成的腦梗死面積，掀起了氫分子作為抗氧化劑的研究熱潮。有報(bào)道證實(shí)，氫分子對腦［3-4］、肝［5］、腎［6］、心［7］、視網(wǎng)膜［8］等組織器官的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。但氫是否對隨意皮瓣移植有保護(hù)作用，相關(guān)研究較少。本研究擬對富氫水提高皮瓣血流量，改善超比例皮瓣存活率及其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SD大鼠72只，雌雄不限，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，體重(250±50)g，2～3個(gè)月齡;術(shù)前喂養(yǎng)2周。

1.2 富氫水制備 氫棒購自天津市凱特康科技有限公司。制作方法:將氫棒、500 ml生理鹽水放入550 ml的塑料瓶中，使其持續(xù)生成氫氣。為保證氫濃度，每24 h更換一次生理鹽水，按說明書定期對氫棒進(jìn)行清洗。用氣相色譜法檢測生理鹽水中氫濃度為0.73 mmol/L，達(dá)到0.60 mmol/L有效氫治療濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 激光多普勒血流監(jiān)測儀(瑞典PERIMED公司)。

1.4 模型制備及分組 將大鼠按隨機(jī)抽簽法分為富氫水組和對照組，每組36只。兩組分別再隨機(jī)分為4組，富氫水組標(biāo)記為 A1、A2、A3、A4，對照組標(biāo)記為 B1、B2、B3、B4，各9只。術(shù)前2周至處死，富氫水組自由飲用富氫鹽水，對照組自由飲用生理鹽水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射，麻醉滿意后，用亞甲藍(lán)在大鼠背部正中設(shè)計(jì)9.0 cm×1.5 cm的矩形超比例皮瓣，蒂在尾側(cè)，距尾端1.5 cm，保留真皮下毛細(xì)血管網(wǎng)。皮瓣完全掀起后，徹底止血，用3-0絲線原位間斷縫合［9］。切口周圍涂抹莫匹羅星軟膏。術(shù)中遵循無菌原則，術(shù)后均單籠飼養(yǎng)。

1.5 標(biāo)本處理 A1和B1、A2和B2、A3和B3、A4和B4分別于術(shù)后即刻及術(shù)后1、3、7 d行頸椎脫臼處死。將皮瓣3等分，分別在皮瓣遠(yuǎn)端、中部切取組織標(biāo)本。用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片行HE染色，光鏡觀察。

1.6 觀察項(xiàng)目及方法

1.6.1 皮瓣大體形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后1～7 d，肉眼觀察皮瓣存活狀態(tài)(包括皮瓣顏色、組織彈性、組織水腫、質(zhì)地、壞死面積等)并記錄。

1.6.2 皮瓣存活率面積比檢測 術(shù)后1、3、7 d，各組大鼠在麻醉狀態(tài)下數(shù)碼照相，用Image-Pro Plus v 6.0圖像分析系統(tǒng)對皮瓣存活面積進(jìn)行分析。按以下公式計(jì)算皮瓣存活面積比:

皮瓣存活面積比=(皮瓣存活面積/皮瓣總表面積)×100%。

皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn):皮瓣顏色發(fā)黑，組織回縮、彈性差，質(zhì)地堅(jiān)硬，切割組織不出血;病理表現(xiàn)為組織崩解，細(xì)胞核消失，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，局部有出血。皮瓣質(zhì)地柔軟，呈粉紅色，有毛發(fā)生長，皮溫正常為存活。

1.6.3 光鏡觀察大鼠皮瓣組織切片 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取皮瓣組織，10%甲醛固定，石蠟包埋切片染色，切片厚度為4 μm，進(jìn)行HE染色。400倍光鏡下觀察組織水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等情況。

1.6.4 激光多普勒血流監(jiān)測儀檢測血流量 在距皮瓣起點(diǎn)1.5、4.5 cm處分別作一標(biāo)記點(diǎn)，代表皮瓣近蒂部、中部，各時(shí)點(diǎn)的測量均固定于這兩點(diǎn)上。測量時(shí)用乙醚吸入麻醉，探頭尖輕輕接觸皮膚組織，保持無壓力接觸，待血流值穩(wěn)定時(shí)，記錄血流值變化。測量時(shí)間點(diǎn)分別為術(shù)前，術(shù)中(皮瓣完全掀起后)，術(shù)后即刻，術(shù)后0.5、1、2、3、4 h，術(shù)后1、3、7 d。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)檢測結(jié)果用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣大體觀察結(jié)果 術(shù)后1 d，兩組均于皮瓣遠(yuǎn)端可見明顯的組織腫脹，呈青紫色，切口邊緣附近見暗褐色斑塊，觸之無彈性并有移動感，皮瓣近蒂部和中部的組織腫脹較遠(yuǎn)端輕。隨后，遠(yuǎn)端皮瓣顏色逐漸加深，呈紫黑色。術(shù)后3 d，遠(yuǎn)端呈現(xiàn)面積不等的壞死區(qū)，見硬黑色痂皮，同時(shí)中部亦出現(xiàn)相應(yīng)的壞死表現(xiàn)，近蒂部表現(xiàn)則不明顯。術(shù)后7 d，兩組存活與壞死區(qū)界限清楚，壞死區(qū)部分干涸回縮，成黑色痂殼，質(zhì)硬，無彈性，針刺無出血。對照組術(shù)后皮瓣壞死表現(xiàn)均較富氫水組明顯，壞死面積也較大。

2.2 皮瓣存活面積比 術(shù)后3、7 d，富氫水組皮瓣存活面積比明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 皮瓣組織學(xué)觀察結(jié)果 兩組皮瓣進(jìn)行HE染色后，于光鏡下觀察。術(shù)后即刻，皮瓣無明顯組織學(xué)改變。術(shù)后1 d，皮瓣組織明顯水腫，大量中性粒細(xì)胞浸潤。術(shù)后3 d，對照組中部(圖1a)皮瓣組織層較厚，組織水腫嚴(yán)重，鏡下見較多的炎癥細(xì)胞浸潤，富氫水組(圖1b)壞死明顯減輕，組織層厚度較小，炎癥細(xì)胞浸潤相對較輕;對照組遠(yuǎn)端(圖1c)及富氫水組遠(yuǎn)端(圖1d)部分壞死嚴(yán)重。術(shù)后7 d，壞死界限明確，對照組中部(圖1e)部分壞死，遠(yuǎn)端(圖1g)完全壞死;富氫水組中部(圖1f)以中性粒細(xì)胞浸潤較前減輕，水腫基本消失，皮瓣遠(yuǎn)端(圖1h)典型缺血性壞死。

表1 兩組術(shù)后皮瓣存活率比較(±s，%)

表1 兩組術(shù)后皮瓣存活率比較(±s，%)

注:與對照組比較，a P＜0.01。

組別 n 1 d 3 d 7 d對照組術(shù)后即刻100±0.00 100±0.00 70.82±2.39 45.71±2.79富氫水組 9 100±0.00 100±0.00 78.34±2.08a 60.43±2.33 9 a

圖1 兩組術(shù)后皮瓣組織學(xué)比較

2.4 皮瓣微循環(huán)血流量 對照組及富氫水組皮瓣近蒂端、中部循環(huán)血流量于術(shù)中皮瓣掀起至術(shù)后7 d均下降。與對照組相比，富氫水組在各時(shí)間點(diǎn)血流值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2、表3。

表2 兩組大鼠皮瓣近蒂端循環(huán)血流量比較(±s，PU)

表2 兩組大鼠皮瓣近蒂端循環(huán)血流量比較(±s，PU)

注:與對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01。

0.5 h 1 h 2 h 3 h 4 h 1 d 3 d 7 d對照組 9 39.76±4.58 12.16±2.35 10.93±3.02 14.27±2.03 12.49±2.16 12.14±4.18 10.91±3.67 11.02±組別 n 術(shù)前 術(shù)中術(shù)后即刻2.23 27.99±2.05 49.23±2.53 56.90±3.45富氫水組 9 49.59±4.85b14.23±1.66a15.49±2.85b 16.09±1.46a 16.21±2.14b 22.43±5.85b 18.05±4.46b18.61±2.25b31.06±2.71a56.65±2.93b65.84±4.83b

表3 兩組大鼠皮瓣中部循環(huán)血流量比較(±s，PU)

表3 兩組大鼠皮瓣中部循環(huán)血流量比較(±s，PU)

注:與對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01。

0.5 h 1 h 2 h 3 h 4 h 1 d 3 d 7 d對照組 9 41.34±5.39 9.51±2.11 9.61±1.21 8.49±3.99 8.94±1.28 8.43±2.22 6.99±1.68 8.14±1.99 10.組別 n 術(shù)前 術(shù)中術(shù)后即刻14±0.99 13.86±2.59 16.75±3.55富氫水組 9 56.94±6.88b12.07±1.77a11.24±1.90a 11.24±2.05a 10.36±1.43a 12.29±2.41b 11.34±2.73b10.80±2.50a11.40±1.31a17.88±4.95a27.13±3.99b

3 討論

皮瓣轉(zhuǎn)移或移植過程中，缺血再灌注損傷及炎癥可引起氧自由基的釋放，導(dǎo)致皮瓣部分或全部壞死［10］。有研究表明，氧化自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、微血管損傷、炎癥細(xì)胞的浸潤及相關(guān)炎癥因子的釋放在皮瓣缺血再灌注損傷過程中均發(fā)揮著重要作用［11-12］。發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡被破壞，如清除氧自由基能力降低或活性氧自由基產(chǎn)生過多，會導(dǎo)致氧自由基蓄積，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的一系列損害［13-15］。

氫能很快透過細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，彌散到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如線粒體、細(xì)胞核等，發(fā)揮保護(hù)作用。其可能作用機(jī)制為:(1)氫具有選擇性抗氧化作用，選擇性地降低羥基(·OH)和過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)濃度，但不會降低超氧陰離子自由基(O-2)、H2O2及處于平衡狀態(tài)的 NO 水平［2］，減少組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及DNA氧化，保護(hù)細(xì)胞功能［5］。(2)抑制組織的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)和促進(jìn)細(xì)胞組織的功能［16］。本研究中，富氫水組術(shù)前2周飲用富氫鹽水，術(shù)前微循環(huán)血流量與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后富氫水組皮瓣水腫較對照組減輕。(3)氫可干預(yù)缺血再灌注損傷時(shí)的延遲細(xì)胞凋亡過程。凋亡在分子水平，可被天冬氨酸-半胱氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)所激活，包括caspase-12、caspase-3 等。Cai等［3］研究表明，氫能通過減少缺氧缺血引發(fā)的caspase依賴性凋亡來提供神經(jīng)保護(hù)。本研究發(fā)現(xiàn)，富氫水組與對照組術(shù)后3、7 d壞死率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

PU為激光多普勒血流監(jiān)測儀測量的基本指標(biāo)，即流動的紅細(xì)胞產(chǎn)生的多普勒位移值，是一個(gè)表示測量深度內(nèi)局部組織微循環(huán)血流量大小的相對單位，PU值的變化直接反映了組織微循環(huán)血流量的改變［17］。本實(shí)驗(yàn)采用激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測超比例皮瓣的微循環(huán)血流量發(fā)現(xiàn)，超比例皮瓣術(shù)后即刻及術(shù)后0.5、1、2、3、4 h，術(shù)后1、3、7 d 血流量明顯下降，表明皮瓣微循環(huán)的損傷和血流量下降是皮瓣壞死的重要原因之一。富氫水組血流量與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究表明，飲用富氫鹽水，可改善皮瓣微循環(huán)，從而提高皮瓣存活率。

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