夏光明，倪小紅，王洲羿，黃虎翔，肖展翅，劉秋梅，李 鋼

CD20作為跨膜的蛋白質(zhì)是一種新型鈣通道，CD20的激活是調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣離子變化的又一個(gè)影響因素，并通過鈣離子變化直接調(diào)節(jié)鈣離子通道活性。本研究采用大鼠局灶性腦缺血模型，用免疫組化和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測局灶性腦缺血CD20的表達(dá)情況，初步探討CD20在局灶性缺血腦組織中的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組 雄性健康SD大鼠28只，體重200 g～250 g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度25℃，自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)室溫度25℃，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組及大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）后3 h組、6 h組、24 h組。實(shí)驗(yàn)分批進(jìn)行，每批含各組大鼠7只。

1.2 試劑與儀器 免疫組化試劑盒購自武漢谷歌生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型的制作 大鼠用10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線左側(cè)旁開約0.5 cm切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA主干以及ICA入顱部。然后在ECA殘端剪0.3 mm小口，將線拴插入，輕推尼龍線尾端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱，遇到阻力，大鼠呼吸心跳加快時(shí)停止。尼龍線插入深度從CCA分叉部計(jì)18.5 mm±0.5 mm。結(jié)扎ECA開口近心端，放開CCA動(dòng)脈夾，縫合傷口，單籠飼養(yǎng)觀察。參考Longa等［1］的方法進(jìn)行動(dòng)物清醒后爬行行為障礙評分：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常者0分；提尾時(shí)病灶對側(cè)前肢不能完全伸直者1分；爬行時(shí)出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈者2分；行走時(shí)身體向?qū)?cè)倒者3分；不能自行行走，意識喪失者4分。1分～3分為入組標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 大鼠以10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。開胸經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，夾閉腹主動(dòng)脈。依次灌注生理鹽水250 mL，4%多聚甲醛PBS緩沖液150 mL。在3 h、6 h和24 h時(shí)間點(diǎn)取出全腦，在多聚甲醛中于4℃下固定36 h。常規(guī)乙醇梯度脫水透明、石蠟包埋，用切片機(jī)自視交叉處向后連續(xù)冠狀切片，片厚7μm。按改進(jìn)的Stermberger PAP法進(jìn)行CD20免疫組織化學(xué)染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色系統(tǒng)顯色；流水終止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，清水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中型樹脂封片觀察。細(xì)胞被染成棕褐色為陽性結(jié)果。同時(shí)做抗體的交叉性試驗(yàn)及空白對照實(shí)驗(yàn)。

1.5 病理組織觀察 取免疫組化反應(yīng)陽性切片的相鄰切片作HE染色，進(jìn)行病理觀察。

1.6 CD20陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù) 取大腦切片的同一層面梗死灶及其周邊選擇上下左右及中央5個(gè)視野，在400倍光鏡下計(jì)數(shù)CD20陽性神經(jīng)元的數(shù)量，所得陽性細(xì)胞數(shù)取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物行為特征 手術(shù)組動(dòng)物在麻醉清醒后均呈現(xiàn)局灶性腦缺血表現(xiàn)：右前爪不能前伸，向右旋轉(zhuǎn)爬行或傾倒。

2.2 HE染色觀察結(jié)果 缺血3 h組神經(jīng)元出現(xiàn)變性；缺血6 h組見皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元呈空泡變性；缺血24 h組大部分神經(jīng)元完全壞死，神經(jīng)元數(shù)量減少，殘存神經(jīng)細(xì)胞核變小、顏色深染。

2.3 CD20免疫組化染色 非梗死側(cè)無陽性神經(jīng)元分布。缺血3 h未發(fā)現(xiàn)CD20陽性神經(jīng)細(xì)胞；缺血6 h出現(xiàn)CD20陽性神經(jīng)元，但著色較淡，彌散分布，多數(shù)表達(dá)于細(xì)胞膜，少數(shù)同時(shí)表達(dá)細(xì)胞漿中。在梗死灶邊緣與正常腦組織交界處CD20陽性神經(jīng)元分布有一明顯的分界線。在梗死灶中細(xì)胞壞死明顯，CD20表達(dá)于細(xì)胞漿中。在梗死后6 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CD20陽性神經(jīng)元的數(shù)量變化明顯（P＜0.01）。詳見表1。

表1 梗死灶陽性CD20神經(jīng)元計(jì)數(shù)（x±s）

3 討 論

CD20分子為膜結(jié)合型蛋白，位于細(xì)胞膜上的脂斑區(qū)，由297個(gè)氨基酸組成的非糖基化磷蛋白，4次穿過細(xì)胞膜，帶有3個(gè)疏水基。分為胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。胞外區(qū)基因長132bp，編碼44個(gè)氨基酸［2］。CD20是新型鈣通道，發(fā)生交聯(lián)甚至超交聯(lián)時(shí)形成的多聚體發(fā)揮鈣通道的功能，使細(xì)胞外鈣離子流入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)CD20靠近脂斑區(qū)Src家族的酪氨酸蛋白激酶并相互激活，啟動(dòng)信號傳導(dǎo)途徑，動(dòng)員內(nèi)源鈣庫。使細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。更有研究表明在人早期胚肝內(nèi)CD20定位于細(xì)胞核內(nèi)，而細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈陰性，但其具體的作用機(jī)制仍有待闡明［4］。

CD20在腦梗死患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)有明顯的升高，而且其表達(dá)越高，神經(jīng)功能缺損越重，提示CD20參與了腦梗死后的炎癥和免疫反應(yīng)［5］。CD20是否在腦梗死病灶及缺血半暗帶中表達(dá)未見有報(bào)道，通過免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)CD20在腦梗死病灶及缺血半暗帶中表達(dá)顯示出明顯的特征。在梗死灶和缺血半暗帶以外的未缺血腦組織中未見到有CD20的表達(dá)，在缺血半暗帶與正常腦組織之間有明顯的分界線；缺血3 h未見到有CD20的表達(dá)；缺血6 h發(fā)現(xiàn)有CD20的輕度表達(dá)，且多數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞膜表達(dá)，少數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞胞漿的表達(dá)；缺血24 h CD20強(qiáng)烈表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞胞漿。根據(jù)CD20在缺血后腦組織表達(dá)的時(shí)空變化特征，推測CD20在缺血6 h左右開始表達(dá)，并且初期表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞的胞膜，隨著缺血的持續(xù)和加重，進(jìn)一步表現(xiàn)為胞漿表達(dá)。腦缺血后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞壞死發(fā)生于缺血后6 h～8 h，其主要的作用機(jī)制就是由于缺血過度誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6］。CD20在腦缺血后的表達(dá)處于發(fā)生細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)期，因此神經(jīng)細(xì)胞CD20表達(dá)的作用機(jī)制可能與鈣超載和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

［1］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84－91.

［2］ 洪海燕，舒翠玲，郭燕翔，等.人CD20胞外區(qū)基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)［J］.免疫學(xué)雜志，2000，116（3）：172－174.

［3］ Deans JP，Li H，Polyak MJ.CD20－mediated apoptosis：Signaling through lipid rafts［J］.Immunology，2002，107（2）：176－182.

［4］ 劉影，唐軍民，唐巖，等.人早期胚胎中CD20陽性細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位［J］.解剖學(xué)報(bào)，2007，38（2）：238－240.

［5］ 夏光明，鄭雅文，李鋼，等.急性腦梗死患者外周血B淋巴細(xì)胞CD19、CD20表達(dá)的臨床研究［J］.中國傷殘醫(yī)學(xué)雜志，2008，16（2）：18－19.

［6］ Arvin KL，Han BH，Du Y，etal.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic－ischemic injury ［J］.Ann Neurol，2002，52（1）：54－61.