張月輝，魏陵博，陳 艷，張 燁

心律失常是急性心肌梗死急性期死亡的重要原因，即使及時開通罪犯血管，缺血再灌注也會誘發(fā)心律失常，但是心律失常抑制試驗（CAST）發(fā)現(xiàn)，應用Ⅰ類抗心律失常藥物后室性心律失常減少，但死亡率卻明顯上升。本研究應用龜靈海馬湯劑干預老年大鼠實驗性心肌梗死所致心律失常，觀察龜靈海馬湯劑對實驗性心肌梗死老年大鼠早搏和細胞免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 25月齡Wistar大鼠（和60歲的人年齡大致相當）48只，雄性，體重500 g±50 g，由山東大學新藥評價中心提供。

1.2 藥物 ①垂體后葉素每支10 U，由上海第一生化藥業(yè)公司及上海生物化學制藥廠聯(lián)合生產(chǎn)；②穩(wěn)心顆粒由山東步長制藥有限公司生產(chǎn)（黨參、黃精、三七、琥珀、甘松），每包9 g，60 kg成年人1 d劑量為27 g，相當于成人劑量0.45 g／kg；③龜靈海馬湯劑（龜板12 g、靈芝15 g、海馬9 g，為60 kg成年人1 d劑量，相當于成人劑量0.6 g／kg）由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室提供；④戊巴比妥鈉由上?；瘜W試劑廠進口分裝。⑤CD4 ELISA試劑盒、CD8 ELISA試劑盒，由上海信帆生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 ①心電圖機，由美國Burdick公司生產(chǎn)。②流式細胞儀，型號 TMB4－Accuri c6，LDZ4－0.8型低速自動平衡微型離心機（北京醫(yī)用儀器廠），精密移液器，F(xiàn)A1104電子分析天平（上海天平儀器廠），XW－80A渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）、DZKW－C型電子恒溫水浴鍋（黃驊市御甲綜合電器廠），80－2離心沉淀器（上海手術器械廠）等。

1.4 方法 將48只大鼠隨機分為4組：龜靈海馬湯劑高劑量組（0.9 g生藥／mL）、龜靈海馬湯劑低劑量組（0.6 g生藥／mL）、模型對照組、穩(wěn)心顆粒組（0.45 g／mL），每組12只。龜靈海馬湯劑高劑量組每天龜靈海馬湯劑9 g／kg灌胃，龜靈海馬湯劑低劑量組每天龜靈海馬湯劑6 g／kg灌胃，分別相當于60 kg成年人1 d劑量的15倍和10倍；穩(wěn)心顆粒組按4.5 g／kg灌胃，相當于60 kg成年人1 d劑量的10倍，灌胃容積1 mL／100 g體重，模型對照組使用等體積蒸餾水。連續(xù)給藥4周。末次給藥后1 h稱重標記，以2%濃度配制戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物，劑量為4 mL／kg，背位固定，將金屬針電極插入大鼠四肢末端皮下，并連接心電圖機，做正常心電圖，然后將垂體后葉素注射液10 U／支（2 mL）用生理鹽水配成2 U／mL，按照0.5 U／kg劑量經(jīng)舌下靜脈于10 s內(nèi)推完，觀察心電圖變化，記錄早搏出現(xiàn)時間、持續(xù)時間。將做完心電圖的大鼠經(jīng)腹主動脈取全血8 mL，其中6 mL放入一試管中分離血清，另外2 mL加入EP管（已編號），用力搖晃EP管，取FITC（異硫氰酸熒光素，fluorescein isothiocyanate）CD4＋10μL滴入各EP管。取FITC CD8＋10μL滴入各EP管中，均勻混合，靜置15 min。各EP管加入溶紅細胞，混勻，室溫靜置12 min后，低速離心5 min，棄上清，加入磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）0.5 min后重見細胞，過300目篩網(wǎng)，上流式細胞儀測得CD4＋，CD8＋。

2 結(jié) 果

2.1 動物完成實驗情況 模型對照組造模時死亡3只；穩(wěn)心顆粒組造模時死亡1只，動物本身有心律失常1只，灌胃期間死亡1只；龜靈海馬湯劑低劑量組造模時死亡1只，動物本身有心律失常1只，注射不成功1只；龜靈海馬湯劑高劑量組造模時死亡1只，動物本身有心律失常1只，注射不成功1只。

2.2 龜靈海馬湯劑抗老年大鼠心肌梗死所致早搏作用 龜靈海馬湯劑高劑量組大鼠心律失常開始出現(xiàn)時間最長，而持續(xù)時間最短，明顯優(yōu)于其他3組；穩(wěn)心顆粒組和龜靈海馬湯劑低劑量組優(yōu)于模型組。詳見表1。

表1 各組大鼠急性心肌梗死所致心律失常開始出現(xiàn)和持續(xù)的時間比較（x±s） s

2.3 龜靈海馬湯劑對老年大鼠急性心肌梗死的保護作用 穩(wěn)心顆粒組、龜靈海馬湯劑高劑量組、龜靈海馬湯劑低劑量組升高T波高度均優(yōu)于模型組；龜靈海馬湯劑高劑量組、穩(wěn)心顆粒組減輕ST段下移程度均優(yōu)于模型組，以高劑量組療效最為顯著。詳見表2。

表2 各組大鼠急性心肌梗死T波高度和ST段下移程度的比較（x±s） mV

2.4 龜靈海馬湯劑對老年急性心肌梗死大鼠免疫功能的影響 龜靈海馬湯劑高劑量組CD4＋含量和CD4＋／CD8＋高于其他3組，CD8＋含量低于模型組。詳見表3。

表3 龜靈海馬湯劑對急性心肌梗死大鼠CD4＋和CD8＋的影響（x±s）

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化（AS）斑塊的不穩(wěn)定是由炎癥增強所致，是非特異性和特異性細胞介導的免疫反應誘發(fā)血管損傷的結(jié)果［1］。吳瓊等［2］研究發(fā)現(xiàn)CD4＋T細胞參與了心肌的缺血再灌注損傷，在壞死心肌組織中出現(xiàn)了較多的CD4＋T的浸潤。Vallejo［3，4］提出晚期AS等慢性疾病臨床并發(fā)癥的主要免疫病理機制，認為機體針對慢性抗原的持續(xù)免疫導致了免疫系統(tǒng)的衰老和重構(gòu)，特別是T淋巴細胞克隆組成發(fā)生改變以及衰老的T淋巴細胞功能出現(xiàn)多樣性，這些衰老的T淋巴細胞新生表達天然殺傷細胞受體（NKRs）和殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）等細胞表面分子，并介導了組織器官的免疫損傷，引起機體內(nèi)炎癥反應顯著增強，導致急性冠脈綜合征（ACS）的發(fā)生。

老年有免疫力降低而心血管事件顯著增加的特點，本研究發(fā)現(xiàn)補腎活血方藥具有抗心肌缺血所致的早搏和改善免疫的功效，用龜靈海馬湯劑干預急性心肌梗死模型老年大鼠，發(fā)現(xiàn)龜靈海馬湯劑組比模型組大鼠心電圖早搏開始出現(xiàn)的時間延長而持續(xù)時間縮短，T波高度較高，ST段下降程度減小，體現(xiàn)了抗心肌缺血和抗心律失常作用，而且高劑量組的作用優(yōu)于穩(wěn)心顆粒和龜靈海馬湯劑低劑量組。實驗還發(fā)現(xiàn)龜靈海馬湯劑高劑量組有使T細胞亞群的CD4＋亞群增加，CD8＋亞群下降的效應，CD4＋分子表達于輔助性及（或）誘導T細胞（TH／TI）表面，CD8＋分子表達于抑制、殺傷性T細胞（TS／TC）表面［5］，其中TH／TI較為重要，占T細胞總數(shù)6 0%左右，起到調(diào)節(jié)免疫作用，而TS／TC有抑制免疫和殺傷攜帶抗原的靶細胞功能，說明高劑量的龜靈海馬湯劑具有調(diào)節(jié)老年大鼠的細胞免疫功能作用。

本方龜板填精益髓為君，靈芝補心氣為臣，海馬補腎壯陽活血為佐，與龜板配合陰陽雙補，又可輔助靈芝活血安神。藥理研究表明，龜甲的煎煮濃縮液可使整體耗氧量降低、痛閾延長、心率減慢等抗陰虛的效應［6］，靈芝既有免疫增強和免疫恢復作用，又有抗變態(tài)反應的作用，對機體的免疫狀態(tài)起著雙向調(diào)節(jié)作用［7］。海馬的水、醇提取物具有促進小鼠免疫功能和抗應激的作用，可增強抗高溫、耐缺氧能力，增加小鼠的脾重，提高碳粒廓清率和吞噬指數(shù)［8］，海馬具有明顯的抗血栓藥理作用，能明顯抑制大鼠實驗性頸動脈血栓和大鼠腦血栓的形成［9］。因此龜靈海馬湯劑對老年大鼠心肌梗死導致的早搏有治療作用，而且可以調(diào)節(jié)其細胞免疫。

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